Способ очистки трипсина Советский патент 1986 года по МПК C12N9/76 A61K35/39 

N5

СО СО со

to 1 Изобретение относится к медицине, в частности биотехнологии, к способам получения протеолитических ферментов. Цель изобретения - повьппение активности целевого продукта. Поставленная цель достигается за счет использования определенного режима экстракции, а также хроматографии на 1,6-диамингексан-целлюлозе, при этом десорбцию целевого продукта осуществляют смесью 28-30% изопропилового спирта и 1,0-1,5% NaCl. Пример 1. Получение биоспе цифического сорбента (1,6-диамингексан-целлюлозы). Бумагу, фильтровальную или хроматографическую, облучают У-лучами на кобальтовой установке или ускоренными электронами, поглощенная доза 2030 при мощности дозы 50,0 2,510 рад/с. После этого 50 г измельченной бумаги (1x1 см) помещают -в колбу емкостью 1 л с обратным холодильником, добавляют 6,2 г 1,6-ди аминогексана, растворенного в воде (количество ГМДА эквивалентно 3% альдегидных групп, содержащихся в 50 г облученной бумаги). Смесь кипя тят в течение 3-х ч. охлаждают, бумагу многократно промывают водой до тех пор, пока рН промывных вод не будет равен 7,0. После этого бумагу отжимают, сушат. Полученный сорбент используют для очистки трипсина. Пример 2. На колонку, заполненную 10 мл сорбента 1,6-диамин гексан-целлюлозы, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером, рН 6,0, наносят 20 мг экстракта из пилорических придатков кеты (рН 6,0), растворенного в 2 мл дистиллированной воды. Эстеразная активность исходно го препарата: 520 ед/мг белка (субстрат ТАМЭ - тозил-Ъ-аргинин метило вьй эфир) - трипсиноподобная активность; 1620 ед/мг белка (субстрат БТМЭ - бензоил-Ъ-тирозин метиловый эфир) - химотрипсиноподобная активность. Промывание колонки проводят 0,01 М фосфатным буфером, рН 6,0. Десорбцию целевого продукта осущест вляют 28%-ным изопропиловым спиртом содержащим 1,0% UaCl. Полученный препарат содержит чис тый трипсин, гомогенный при; электро форезе в полиакриламидном геле. 922 Выход препарата от сорбированного трипсина составляет 88%, удельная активность - 5200 ед/мг белка (субстрат ТАМЭ), что в 10 раз выше трипсиноподобной активности исходного препарата; химотрипсиноподобная активность отсутствует в конечном продукте. Пример 3. Все операции проводят по примеру 2 за исключением того, что для экстракции целевого продукта и его хроматографии используют 0,01 М фосфатный буфер, рН 6,2. Удельная активность препарата 5200 ед/мг белка. . Пример 4. Все операции проводят по примеру 2 за исключением того, что десорбцию целевого продукта осуществляют 30%-ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,2% NaCl. Выход целевого продукта от сорбируемого составляет 90%, удельная активность (субстрат ТАМЭ) - 5720 ед/мг белка, что в 11 раз выше трипсиноподобной активности исходного препарата Конечный продукт электрофоретически гомогенен и не содержит химотрипсиноподобной активности. Пример 5о Все операции проводят-по примеру 2, за исключением того, что десорбцию целевого продукта осуществляют 30%-ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,5% NaClo Выход целевого продукта составляет 84,5, удельная активность 6000 ед/мг белка (субстрат ТАМЭ). Использование изопропилового спирта и NaCl для десорбции трипсина в концентрациях, вьш1е или ниже указанных в формуле, приводит к снижению его активности на 20-30%. Применение же одного спирта без NaCl дает незначительный выход фермента. Характеристика препарата трипсина представлена в табл. 1 и 2. Формула изобретения Способ очистки трипсина путем по-, лучения экстракта из пилорических придатков лососевых рыб и его хроматографии на 1,6-диамингексан-носителе, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, экстракцию проводят фосфатным буфером рН 6,0-6,2 с последующей хроматографией на 1,63-диамингексан-целлюлозе в том же буфере и десорбцией целевого продукта 12733924 смесью 28-30% изопропилового спирта и 1,0-1,5% NaCl. Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения - повьшение активности целевого продукта. На колонку, заполненную сорбентом 1,6-диамингексан-целлюлозы, уравновешенную фосфатным буфером с рН 6,0-6,2, наносят экстракт из пилорических придатков кеты. Промывание колонки проводят фосфатным буфером. Десорбцию целевого продукта осуществляют 2830% изопропиловым спиртом, содержащим 1-1,5% NaCl. Полученный препарат содержит чистый трипсин, гомогенньй при электрофорезе в полнакриламидном б геле. 2 табл. (О

Таблица