Способ выделения 4-и/или 5-оксииндолил-3-уксусных кислот Советский патент 1993 года по МПК C12P17/04 C07D209/04 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности.

Цель изобретения - повышение качества целевых продуктов и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что хроматографию проводят на гидрофильных анионообменных носителях перед экстракцией, при этом элюцию продуктов осуществляют 0,5-0,7 М NaCI.

Способ заключается в том, что раствор, содержащий смесь оксииндолилуксусных кислот, подвергают хроматографии на гидрофильном анионообменном сорбенте, используя элюцию 0,5-0,7 М NaCI, затем фракции, содержащие соответственно 4- ОН-ИУК или 5-ОН-ИУК, концентрируют в вакууме до небольшого объема, полученные концентраты подкисляют до рН 3-4 и экстрагируют целевые продукты гидрофобным органическим растворителем, например этилацетатом.

Этилацетатный экстракт, содержащий 4-ОН-ИУК, обезвоживают сульфатом натрия, упаривают под вакуумом досуха. Получают аморфный порошок белого цвета с содержанием основного вещества не ниже 98% и выходом 75-98% от содержания в исходном растворе.

Этилацетатный экстракт, содержащий 4-ОН-ИУК, обезвоживают сульфатом натрия, упаривают под вакуумом досуха. Получают аморфный порошок белого цвета с содержанием основного вещества не ниже 98% и выходом от содержания в исходном растворе.

Этилацетатный экстракт, содержащий 5-ОН-ИУК, обезвоживают сульфатом натрия, упаривают под вакуумом до минимального объема и оставляют на холоду Выпавшие кристаллы отфильтровывают и сушат под вакуумом. Получают белый кристаллический порошок с содержанием основного вещества не ниже 99% и выходом

(/

С

ос

ьо

hO 00 Об

ел

86-98.5% от содержания 5-ОН-ИУК в исходном растворе.

Способ может быть использован для выделения и очистки 4- и 5-ОН-ИУК из растворов, их содержащих, как в индивидуальном виде, так и в смесях, в том числе из фильтратов культуральной жидкости грибов.

Проведение хроматографии на гидрофильных аниоиообменных сорбентах в условиях элюции 0,5-0,7 М NaCI на первом этапе очистки, а при выделении из культуральной жидкости грибов непосредственно после отделения биомассы, позволяет сразу четко разделить два продукта и одновременно освободиться от окрашенных примесей, что дает возможность при дальнейшей экстракции получить сразу чистый продукт. Нами быпо установлено, что при использовании для элюции растворов хлористого натрия с концентрацией менее 0,5 М снижается выход целевых продуктов. Увеличение концентрации NaCI с 0,7 М до 1.0 М не приводит к улучшению качества разделения и увеличения выхода продуктов. Применение в качестве элюентов аммонийных солей, например МН СНзСОО и(, приводило к снижению качества получаемых продуктов, появлению окрашенных примесей в процессе элюции и снижению содержания 4- и 5-ОН-ИУК в конечных препаратах.

Пример1.2л фильтрата культураль- кой жидкости гриба Asperglllus nlger ИБФМ F-212, содержащего 0.22 г/л 5-ОН-ИУК и 0,28 г/л 4-ОН-ИУК, пропускают через колонку 2,2x40 см, заполненную ДЭАЭ-сефадек- сом А-25, со скоростью 50 мл/час. Затем осуществляют элюцию целевых продуктов 0,5 М NaCI с той же скоростью, Отбирают фракции по 100 мл. определяя в них содержание продуктов методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрически по поглощению при 280 нм. Фракции 9-13, содержащие 5-ОН-ИУК. объединяют, упаривают в вакууме до 50 мл. Концентрат подкисляют до рН 3,5 2 М HCI и 5-ОН-ИУК экстрагируют многократно этилацетатом. Экстракт обезвоживают сульфатом натрия и упаривают досуха. Получают 400 мг кристаллического порошка белого цвета 5-ОН- ИУК с содержанием основного вещества 100%. Выход продукта от содержания его в фильтрате составляет 98,5%.

Фракции 16-19, содержащие 4-ОН-ИУК. объединяют, упаривают в вакууме до 100мл. Полученный концентрат подкисляют 2 М HCI до рН 3,5 и экстрагируют из него 4-ОН- ИУК этилацетатом. Экстракт обезвоживают сульфатом натрия, упаривают в вакууме досуха. Получают 550 мг аморфного порошка

белого цвета с содержанием 4-ОН-ИУК 99,8%. Выход продукта от содержания его в фильтрате составляет 98,2%.

Пример 2. Юл фильтрата культуральной жидкости гриба Asp.nlger ИБФМ F-212, содержащего 0,3 г/л 5-ОН-ИУК и 0,2 г/л 4-ОН-ИУК, пропускают со скоростью 200 мл/час через колонку (6x150 см), заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, переведенной в

0 ОН-форму и промытой водой. По окончании сорбции проводят элюцию 0,5 М NaCI со скоростью 150 мл/ч. Отбирают фракции по 200 мл с помощью автоматического коллектора.

5 Фракции, содержащие 5-ОН-ИУК (,5 л, ,2 г/л) объединяют, упаривают под вакуумом до 300 мл, доводят рН до 3,8 с помощью 2 М HCI. Экстрагируют дробно (3-4 раза) этилацетатом до полного извлече0 ния 5-ОН-ИУК из водного слоя. Этилацетат- ный экстракт ( мл, ,4 г/л) высушивают безводным сернокислым натрием, упаривают под вакуумом до объема 8,5 мл и оставляют при 4-6°С в течение

5 ночи. Выпавшие кристаллы отфильтровывают на стеклянном фильтре, промывают холодным этилацетатом и сушат в вакуум-сушильном шкафу при комнатной температуре. Получают 2,0 г белого порош0 ка с содержанием основного вещества 99,8%. Надосадочную жидкость упаривают до 2 мл и охлаждают. Выпавшие кристаллы сушат. Получают 0,7 г кристаллического порошка белого цвета с содержанием основ5 ного вещества 99,5%. Суммарный выход составляет 90% от содержания 5-ОН-ИУК в фильтрате культуральной жидкости.

Фракции, содержащие 4-ОН-ИУК, объединяют (,8 л, ,71 г/л), упаривая под

0 вакуумом до 200 мл, подкисляют до рН 3,8, экстрагируют дробно этилацетатом. Этила- цетатный экстракт ( мл, ,8 г/л) высушивают безводным сульфатом натрия и упаривают под вакуумом досуха. Получают

5 1,5 г белого аморфного порошка с содержанием основного вещества 98,5%. Выход составляет 75% от содержания 4-ОН-ИУК в фильтрате культуральной жидкости.

Пример 3. 10л фильтрата культураль0 ной жидкости гриба Asp.nlger ИБФМ F-212, содержащей 0,25 г/л 4-ОН-ИУК и 0,25 г/л 5-ОН-ИУК, наносят на колонку (3x45 см) с ДЭАЭ-сфероном (фирма Chemapol, ЧСФР) со скоростью 200 мл/час. Элюцию

5 ведут 0,5 М NaCI со скоростью 200 мл/час, отбирая фракции по 200 мл.

Фракции, содержащие 4-ОН-ИУК, очищают далее, как указано в примере 2, и получают белый аморфный порошок весом 2,0 г с содержанием основного вещества

98% и выходом 80% от содержания в фильтрате культуральной жидкости.

Фракции, содержащие 5-ОН-ИУК, объединяют, подкисляют до рН 3,6 и далее очищают, как указано в примере 1. Получают 2,4 г кристаллического порошка с содержанием основного вещества 99,5% и выходом 96% от содержания в фильтрате культуральной жидкости.

Пример 4. Юл фильтрата культураль- ной жидкости гриба Asp.nlger F-212, содержащего 0.2 г/л 4-ОН-ИУК и 0,3 г/л 5-ОН-ИУК, очищают как указано в примере 3, но в качестве анионообменного сорбента используют QAE-сефадекс в колонке 3x80 см.

Получают 1,6 г белого аморфного порошка 4-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 98% и выходом 80% от содержания в фильтрате и 2,8 г кристаллического белого порошка 5-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 100% и выходом 93,3% от содержания в фильтрате культуральной жидкости.

П р и м е р 5. Способ осуществляют как в примере 2, но в качестве элюента используют 0,7 М NaCI. Получают 2,6 г кристаллического порошка 5-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 99% и 1,6 г белого аморфного порошка 4-ОН-ИУК с содержа- нием основного вещества 98,2%. Выход 5- и 4-ОН-ИУК от содержания их в фильтрате культуральной жидкости составляет соответственно 86% и 80%.

Пример 6. 1л раствора, содержащего 1 г 4-ОН-ИУК и 1 г 5-ОН-ИУК, пропускают через колонку 2,0 х 30 см, заполненную ДЭАЭ-сфероном. со скоростью 50 мл/ч. Элюцию осуществляют 0,5 М NaCI. Фракции, содержащие 5-ОН-ИУК, объединяют, упаривают до 100 мл упаренный концентрат

подкисляют до рН 3,5, 5-ОН-ИУК экстрагируют этилацетатом до полного извлечения. Экстракт высушивают над безводным NaaSOa, упаривают досуха. Получают 970 мг кристаллического порошка с содержанием 5-ОН-ИУК 100% (выход 97%).

Фракции, содержащие 4-ОН-ИУК, объединяют, упаривают до 100 мл, подкисляют до рН 3,05.4-ОН-ИУК экстрагируют этилацетатом до полного извлечения. Экстракт высушивают над безводным сульфатом натрия, упаривают досуха. Получают 950 мг белого аморфного порошка с содержанием 4-ОН-ИУК 99,5% (выход 95%).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качество препаратов 4- ОН-ИУК до 98-99,8% и 5-ОН-ИУК до 100% при сохранении, а при получении 5-ОН-ИУК и повышении выхода за счет четкого отделения этих соединений друг от друга и от примесей в процессе хроматографии, а также упростить процесс получения целевых продуктов за счет сокращения стадий выделения и очистки и за счет сокращения операций, где используются органические растворители. Кроме того, способ позволяет уменьшить взрывоопасность и пожароопас- ность производства.

Формула изобретения

Способ выделения 4- и/или 5-оксииндо- лил-3-уксусных кислот из раствора, предусматривающий экстрагирование гидрофобным органическим растворителем и хроматографи- ческое разделение целевых продуктов, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевых продуктов и упрощения способа, стадию хроматографического разделения проводят перед стадией экстрагирования путем сорбции целевого продукта на гидрофильном анионообменном сорбенте и элюции 0,5-0.7 М раствором NaCI.

Использование: биотехнология, медицинская промышленность. Сущность изобретения: раствор, содержащий смесь 4- и 5-оксииндолил-З-уксусных кислот, подвергают хроматографии на колонке, заполненной гидрофильным анионообменным сорбентом и элюируе- мой 0,5-0.7 М раствором NaCI. Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают, подкисляют до рН 3-4 и экстрагируют гидрофобным органическим растворителем. Полученные экстракты обезвоживают, упаривают и выделяют продукт с выходом 75-98% и содержанием основного вещества 98%.