Способ получения производственных штаммов вируса клещевого энцефалита Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

ных классических очагах клещевого энцефалита восточного антигенного варианта, изученных на втором - третьем пассажах через мозг нелинейных белых мышей массой 6-8 г, по следующим признакам: нейровирулен- тность при внутримозговом введении беспородным белым мышам должна быть в пределах 9,0-11,0, при периферическом введении - 8,0-9,72 Ig ЛДво/мл, индекс инвазивности в пределах 0,42-1,6 (в Ig ЛДзо/мл), гемагглютинирующая активность штамма при репродукции в мозгу мышей в пределах 1:1280-1:10240 в зонах рН 6,0-7,0; антигенная активность, выраженная в и ндексе нейтрализации штамма с гомологичной сывороткой - в пределах 2,6-3,8 (в Ig ЛДзд/мл); индекс инактивации штамма эфиром - в пределах 2,5-5,0; индекс терморези- стентности (Тбо) в пределах 0,7-2,8; бляшкообразующая активность 8,1-10,1 Ig БОЕ/мл, цитопатическая активность 8,2-9,5 Ig ТЦДзо; S - признак (диаметр бляшек в мм) - на 4-7 сутки 1,0-4,5 мм, соответственно.-

При отборе штаммов вируса для производства диагностических препаратов кроме того учитывают наиболее раннее проявление гемагглютинирующей активности в исходных пассажах на мышах.

Способ отбора осуществляется следующим образом: берут 50-70 штаммов природной популяции вируса клещевого энцефалита, выделенных из клещей I. persulcatus в классическом очаге клещевого энцефалита восточного антигенного варианта и на 2-3 пассаже через мозг белых мышей изучают основные признаки антигенной и биологической активности. В частности инфекционную активность определяют по нейровирулентности при внутримозговом и экстраневральном введении штаммов вируса белым мышам (Ig ЛДэд/мл) и инвазивности; гемагглютинирую- щую активность в РГА в различных зонах рН среды. Исследуют также физико-химические признаки: терморезистентность (Tso), устойчивость по отношению к эфиру. Антигенную активность определяют по уровню титров антител в РБН; тест нейтрализации применяют также для идентификации изучаемых штаммов. Антигенные связи штаммов изучают в РТГА и РСК с набором антисывороток к западным и восточным вариантам вируса. Оценку производят по выраженности показателей (табл.1).

Так нейровирулентность при внутри- мозговом введении нелинейным белым мышам должна быть в пределах 9,0-11,0. при перифрическом введении - 8,0-9,72, индекс инвазивности - в пределах 0,42-1,6 (в

Ig ЛДю/мл), геммаглютинирующая активность штамма при репродукции в мозгу мышей в пределах 1:1280-1:10240 в зонах рН 6,0-7,0, индекс биологический нейтрализации штамма с гомологичной сывороткой в пределах 2,6-3,8 (в Ig ЛДвд), индекс термо- резистентности в пределах 0,7-2,8, индекс инактивации штамма эфиром - в пределах 2,5-5,0.

При отборе штаммов вируса для производства диагностических препаратов кроме того учитывают наиболее раннее появление гемагглютинирующей активности в исходных пассажах.

5 Пример. Штамм Vlrl Ixodlcl encephalitldls № 7 выделен в мае 1985 года из самок клеща I. persulcatus, обитающих в зоне хвойно-широколиственных лесов района им. Лазо Хабаровского края.

0 Штамм выделен на 8 день после заражения в мозг мышей суспензий клещей, на 1 пассаже-инкубация - 6 дней. Изучение штамма проведено на уровне 2-3 пассажа через мозг мышей по следующим призна5

кам: нейровирулентность при внутримоэговом введении беспородным белым мышам в Ig ЛДво/мл - 9,12-9,5 Ig ЛДвд/мл при инкубационном периоде клиники 4-5 дней; нейровирулентность при подкожном введении в

0 1дЛД50/мл - 8,0 Ig ЛДзо/мл. при инкубационном периоде проявления клиники - 5- 6 дней, индекс инвазивности (II) - 1,12-1,5 Ig ЛДБО/МЯ, индекс нейтрализации (IW) - 3,5- 3,8 Ig ЛДбо, гемагглютинирующая актив5 иость 1:2560 в зоне рН - 6,2-6,7; чувствительность по отношению к эфиру - 2,8 Ig ЛДбо/о.оз; индекс терморезистентно- сти (Tso) - 0,72 Ig ЛДю/о.оз.

Штамм хорошо размножается в переви0 ваемой культуре клеток СПЭВ, вызывая цитодеструкцию клеток на 4-5 сутки, титр - 9,0-9,5 Ig ТЦДзо/мл; образует на 4 сутки бляшки на культуре СПЭВ под агаровым покрытием, титры штамма по бляшкообра5 зующей активности 9,5 Ig БОЕ/мл; размер бляшек (S-приэнак) - 1.0-1.5 мм, к 7 суткам размер бляшек - 2,5-4,5 мм; морфологическая характеристика бляшек: округлой формы, с диффузным краем.

0 Штамм имеет близкое антигенное родство с западным и восточным антигенными вариантами вируса клещевого энцефалита.

Штамм № 7 использован для получения

5 эталонной имунной асцитической мышиной жидкости (ИАЖ) и для получения типо- специфических сывороток для РТГА и РСК, применяемых для серодиагностики и идентификации штаммов вируса клещевого энцефалита.

Перечисленные признаки штамма № 7 укладываются в параметры схемы отбора (табл.1) и характеризуют его, как наиболее активный среди штаммов изученной популяции.

Преимущество предлагаемого способа отбора по сравнению с известными состоит в том, что популяционный подход позволяет оценить полно практически всю совокупность генофонда природной популяции в очагах, где возникают тяжелые паралитические формы клещевого энцефалита, и выбрать наиболее вирулентные штаммы, отличающиеся высокой репродуктивной способностью при размножении в мозге мышей и в культуре ткани куриного эмбриона - свойств, полезных для производства.

Имеется возможность направленного отбора штаммов с определенными характеристиками - например, штамм № 7, отлича- ющийся активностью преимущественно по антигенным свойствам.

Спектр антигенной активности штаммов должен быть достаточен для образования антител по отношению к восточному и западному вариантам вируса КЭ. что свойственно отобранному штамму № 7.

В перекрестной РТГА и РСКс использованием гипериммунных сывороток и ИАЖ

выявлено тесное антигенное родство штамма Nfe 7 с западными и восточными штаммами вируса КЭ (табл.2).

Формула изобретения Способ получения производственных штаммов вируса клещевого энцефалита, включающий первичное выделение изоля- тов вируса из клещей Ixodes persulcatus и отбор штаммов по биологическим характеристикам, отличающийся тем, что, с целью повышения репродуктивное™ и им- муногенной активности, отбор штаммов осуществляют на 2-3-м пассаже после первичного выделения по следующим биологическим характеристикам: нейровиру- лентность при внутримозговом введении - 9,0-11,0; то же при периферическом введении - 8.0-9,72; индекс инвазивности - 0,42- 1,6; гемагглютинирующая активность при репродукции в мозгу мышей 1:1280-1:10240 при рН 6,0-7.0; индекс биологической нейтрализации с гомологичной сывороткой - 2.6-3,8; индекс инактивации эфиром 2,5-5,0 Од ЛДэо /0,03 мл), индекс терморезистент- ности при 50°С - 0,7-2,8; размер бляшек на 4-7-е сутки после заражения клеток - 1,0- 4,5 мм; бляшкообразующая активность не ниже 9,5 БОЕ/мл и цитопатическая активность 9,0-9,5 ед. ТЦДю/мл.

Использование: медицинская вирусология, биотехнология. Сущность изобретения: отбор штаммов ведут из свежевыделенных Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к способам отбора высокоактивных штаммов вируса для производства инактивированных вакцин и диагностических препаратов. Целью изобретения является разработка способа отбора штаммов вируса клещевого энцефалита с высокой антигенной и биологической; активностью для производства инактивированных вакцин, диагности- кумов и биологических реагентов для типирования штаммов (типоспецифических штаммов природной популяции вируса из клещей Ixodes persulcatus, обитающих в наиболее типичных классических очагах клещевого энцефалита восточного антигенного варианта, изученных на II-III пассажах по следующим признакам: нейровирулент- ность (Ig ЛДэо/мл) при внутримозговом введении в пределах 9,0-11,0; при периферическом введении 8,0-9,72; индекс инва- зивности 0,42-1,6; гемагглютинирующая активность штамма при репродукции в моз- .гу мышей в пределах 1:1280-1:10240 в зонах рН 6,0-7,0. индекс биологической нейтрализации с гомогологичной сывороткой в пределах 2,6-3,8; индекс инактивации эфиром 2,5-5,0 (Ig ЛДбо/0,03 мл), индекс терморези- стентности (Tso) 0,7-2,8; бляшкообразую- щая активность (Ig БОЕ/мл) 9,5; S - признак (размер бляшек в мм на 4-7 сутки) 1,0-4,5 соответственно; цитопатическая активность (Ig ТЦД БО/МЛ) 8,2-9,5. В заключительный этап отбора предусматривается соответствие целям: получение вакцин, диагностикумов, биологических реагентов. 2 табл. сывороток и иммунных асцитических жидкостей - ИАЖ). Это достигается тем, что отбор ведут не эмпирическим путем, а на основе популяци- онного подхода. Он означает многокомпонентный анализ популяции, определение источников выделения штаммов и выбор из охарактеризованного набора штаммов адекватного штамма на основе целей. Отбор ведут из свежевыделенных штаммов природной популяции вируса из клещей I. persulcatus, обитающих в наиболее типичел с оо 00 со 4 00

Признаки отбора штамма вируса клещевого энцефалита с высокой антигенной и биологической активностью (штамма № 7)

Таблица 1

Антйгенная характеристика штамма N 7 (по данным РТГА и РСК)

) титры даны в обратных величинах н/и - не исследовали

Таблица 2