Способ определения биологической активности культуры микроорганизмов Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/06 

Изобретение относится к микробиологии и предназначено для определения метаболических взаимодействий микроорганизмов.

Известен метод агаровых блочков, согласно которому антагонистическую активность испытуемых культур определяют по диаметру зоны отсутствия роста тест-культуры вокруг агаровых блочков, на поверхности которых находятся испытуемые культуры.

Однако при поточной работе с большим количеством испытуемых культур и тест- культур метод агаровых блочков требует больших затрат рабочего времени, а также обладает недостаточно высокой точностью определения биологической активности культур.

Целью изобретения является сокращение времени и повышение точности опреде- ления биологической активности микроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем,ШГ перед посевом тест-культур со среды снимают слой с выросшей испытуемой культурой, параллельно тест-культуры засевают на чистую агаризованную среду, после инкубирования измеряют диаметры выросших колоний, а биологическую активность определяют по соотношению диаметров колоний тест-культур на опытной и контрольной средах.

На фиг. 1 изображен репликатор; на фиг. 2 -схема чашки Петри, заполненной слоем агаровой питательной среды, на которой расположена агаровая пластинка, засеянная испытуемой культурой (а) и на которой репликатором нанесены тест-культуры, после удаления из чашки агаровой пластинки с испытуемой культурой (б), вид сбоку ; на фиг. 3 - колонии тест-культур, выросшие в опыте и контроле, по соотношению диаметров которых судят о биологической активности испытуемой культуры.

Сущность метода агаровых пластинок с использованием репликатора заключается в том, что испытуемую культуру засевают на агаровую пластинку, помещенную в чашку Петри на поверхность твердой питательной среды. По истечении срока выращивания испытуемой культуры агаровую пластинку удаляют из чашки и на нижний слой твердой среды наносят с помощью репликатора од

&

ч ел ю

ч|

VJ

новременно до 23 тест-культур (число тест- культур определяется числом лунок в стани- не репликатора). Параллельно тест-культуры засевают на чистую агаризо- ванную среду и после инкубирования измеряют диаметры выросших колоний. Биологическую активность определяют по соотношению диаметров колоний тест-культур на опытной и контрольной средах.

Пример. Биологическую активность четырех испытуемых культур Mycobacterium mucosum BKM 462, Bacilluscereus BKM 504, Pseudomonas melochlora BKM 877, Candida mycoderma BKM y-933 изучали методом агаровых пластинок с использованием репликатора, В качестве тест-культур использовали Streptococcus faecalis BKM 6, Mycobacterium lacticolum BKM 355, Mecobacterlum mucosum BKM 462, Bacillus cereus BKM 504, Pseudomonas gracilis BKM 551, Pseudomonas meiochlora BKM 877. Azotobacter chroococcum BKM 888. Опыты проводили в 5-кратной повторное™. Питательной средой служит пептонный агар (1 % пептона, 0,5% Nad, 2% агара). Для приготовления агаровых пластинок в стеклянное кольцо диаметром 60 мм, находящееся в стерильной чашке Петри, пипеткой наливали теплую агаризованную среду толщиной 2 мм После того как среда застывала, стерильным пинцетом удаляли колъцо из чашки. Агаровую пластинку переносили в центр доугой чашки, заранее заполненной 35 мл пептонного агара Таким образом готовили чашки для всех испытуемых культур с учетом 5-кратной повторности и контрольные чашки, т.е 25 чашек. Затем из 2-суточной испытуемой культуры по оптическому стандарту мутности на 10 ед. готовили суспензии. Испытуемые культуры (0,05 мл) высевали газоном на поверхность агаровых пластинок. Контрольные чашки не засевали испытуемыми культурами Чашки инкубировали в термостате при температуре 28°С в течение 2 сут, после чего специальной лопаткой агаровые пластинки с испытуемыми культурами удаляли из чашек. В результате получили 20 чашек со стерильной агаризованной средой, содержащей продукты жизнедеятельности четырех испытуемых культур, и 5 контрольных чашек, со стерильной средой без продуктов жизнедеятельности испытуемых культур

В каждую чашку на поверхность среды репликатором наносили одновременно все тест-культуры Для этого из 2- суточных тест-культур готовили суспензии по стандарту мутности на 10 ед , которыми заполняли лунки станины репликатора. Погружая штырьки репликатора в лунки, переносили

суспензии тест-культур на поверхность агаровой среды. Через 3 сут роста тест-организмов в термостате измеряли диаметры опытных и контрольных колоний тест-микробов.

Соотношение средних значений диаметров опытных и контрольных колоний в процентах приведено в табл 1. Типы действия обозначены ± - положительное действие, - - отрицательное действие 0 нейтральноре действие. Действие испытуемой культуры считали положительным или отрицательным в зависимости от того, больше или меньше диаметр колоний в опыте по сравнению с контролем.

Для удобства результаты экспериментов переводили в бальную систему (табл. 2) следующим образом. При разнице в диаметрах контрольной и опытной колоний 0-19% действие оценивали как нейтральное, при разнице колоний 20-39% действие оценивали в ± 1 балл, при разнице 40-59% - в ± 2 балла, при разнице от 60-79% - в ± 3 балла, при разнице свыше 80% - в ± 4 балла.

Таким образом, из 28 рассмотренных в

эксперименте случаев методом агаровых пластинок с использованием репликатора выявлено 10 нейтральных, 1 положительное и 17 отрицательных действий, в том числе 8 бактерицидных (-4 балла). Для сравнения

этот же эксперимент был проведен методом агаровых блочков по стандартной методике. В результате из 28 изученных методом блочков действий 7 оказались отрицательными и 21 нейтральными. Во всех случаях, когда

методом агаровых блочков установлено отрицательное действие испытуемой культуры на рост тест-культуры, методом агаровых пластинок также выявлено отрицательное действие со 100%-ным ингибированием роста тест-культур, т.е. бактерицидное Еще в 10 случаях, когда методом агаровых пластинок зарегистрированы отрицательные действия, главным образом бактериостатические, методом блочков не было обнаружено какойлибо биологической активности у испытуемых культур. Также метод агаровых блочков не позволяет выявить положительные действия культур, тогда как метод агаровых пластинок не только позволяет выявить такие

действия, но и измерить их силу Таким образом, анализ сравнения результатов экспериментов показал, что метод агаровых пластинок с использованием репликатора позволяет выявлять более широкий спектр

биологической активности испытуемых культур, чем метод агаровых блочков.

Предлагаемый метод является экспресс-методом. Позволяет в одной чашке Петри изучить в 3 раза больше микробных

действий, чем метод блочков, в связи с чем более экономичен по времени, питательным средам, стерильной посуде.

Формула изобретения Способ определения биологической активности культуры микроорганизмов, предусматривающий инкубирование испытуемой культуры на агаризованной среде с последующим подсевом набора тест-культур, повторное инкубирование посевов и определение биологической активности ис0

пытуемой культуры по степени роста тест- культур, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени и повышения точности определения, перед посевом тест- культур со среды снимают слой с выросшей испытуемой культурой, параллельно тест- культуры засевают на чистую агаризован- ную среду, после инкубирования измеряют диаметры выросших колоний, а биологическую активность определяют по соотношению диаметров колоний тест-культур на опытной и контрольной средах.

Применение: определение биологической активности культуры микроорганизмов, их метаболических взаимодействий, Сущность: после выращивания испытуемой культуры на агаризованной среде с нее снимают слой с выросшей испытуемой культурой и подсевают набор тест-культур. Параллельно тест-культуры засевают на чистую агаризованную среду. Биологическую активность определяют по соотношению диаметров колоний тест-культур на опытной и контрольной средах. 3 ил., 2 табл.

Т а б л и ц а 1

Таблица2

ФАГ. 1

Фиг. 2

Редактор В.Петраш

Составитель О.Корженко

Техред М.МоргенталКорректор О.Юрковецкая

Фиг. 3