Способ получения азотсодержащего полисахарида, промотирующего чувствительность к лекарствам у бактерий, устойчивых к антибиотикам Советский патент 1980 года по МПК A61K31/715 

Вещество представляет собой поро кообразный к коричневый по цвету ма териал, который не имеет определенн температуры плавления и карбонизует при сильном нагревании. Оно не раст воряется в органических растворителях, таких как пиридин, хлороформ, |бензол, гексан и т.д., но растворяется в воде. Инфракрасный спектр этого вещест ва характеризуется наличием полос п глощения в области 3600-3200 см , 2920-2900 см 1660-1610 см 1460 1410 см , 1360 см-, 1230 cм- 1150 1080 см-, 1060-990 см 925 смЧ 890 см- 840 см 755 см и Таким -образом, в ИК-спектре азотсодержащего полисахарида имеется полоса поглощения в области 890 см, характерная для |Ь-связей глюкана в . харидной части молекулы, и другая п лоса поглощения в области 840 см пот-лгнпрния и пйпяг-ти ЙЛП г-м характерная для ck-связей глюкана. Элементарный анализ азотсодержащего полисахарида показывает -следую щий состав.вещества: содержание угл рода от 42 до 46%, содержание водорода от 5,3 до 7,0% и содержание аз та от 0,5 до 8,0%. Все остальное по балансу приходится на долю кислорода. Оптическое вращение азотсодержащ го полисахарида, определенное стандартным методом и выраженное через величину удельного оптического вращения dv варьируется от О до 50 . Азотсодержащий полисахарид дает положительную реакцию с фенолсерной кислотой, положительную реакцию - с антронсерной кислотой и положительную реакцию с нингидрином. Тот факт что это вещество дает положительные цветные реакции с указанными реаген тами, является свидетельством того, что активное вещество включает в своем составе сахаридную и белковую часть, т.е. является гликопротеином Для определения углеводного состава азотсодержащего полисахарида образец вещества гнцролизуют метанольным раствором хлористоводородной (соляной ) кислоты и, после триметилсилили рования известным методом, анализируют гидролизат - методом газо-жидкостной хроматографии. Результаты анализа показали, что полисахарид состоит в основном из глюкозы, а так же содержит маннозу, галактозу, ксилозу и фукозу. Аминокислотный ана лиз белковой части азотсодержащего п лисахарида позволил определить, что белковая часть вещества включает в своем составе аспарагиновую кислоту треонин, серии, глутамйновую кислоту, пролин, глицин, аланин, цистин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, триптофан, фенилаланин, лизин, гистидин и аргинин.Основная доля среди этих аминокислот приходится на аспарагиновую кислоту, треонин, глутамйновую кислоту, глицин, аланин, валин и лейцин. Суммарная доля этих аминокислот от общего аминокислотного состава составляет более 70%. Исследование азотсодержащего полисахарида методом, ядерного магнитного ,резонанса проводят с целью определе- ния отношения между углеводной (сахаридной) и белковой частями в указанном веществе, а также для. уточнения типа связей в углеводной части этого вещества. Спектр протонного магнитного резонанса (ИМР-спектр) образца азотсодержащего полисахарида снимают на ЯМР-спектрометре с напряженностью магнитного поля в 100 мегагерц, используя в качестве растворителя тяжелую воду, а в качестве внутреннего стандарта 2,2-диметил-2-силанопентан-5-сульфонат. В спектре ЯМР исследуемого вещества имеются полосы поглощения в области 0,9-0,2-1,,2 миллионных долей, 2,0±0,2 миллионных долей, 4,5tO,2 миллионных долей, 4,,2 миллионных долей, 5,,2 миллионных долей и 5,,2 миллионных долей соответственно, в спектре видна также широкая полоса поглощения в области 3,4-4,4 миллионных долей. Белковая компонента вещества изучена, исходя из допущения, что область от 0,5 до 2,5 миллионных долей ..связана с интенсивностью сигналов : ротонов белковой части образца, а область от 2,5 до 6,0 миллионных долей связана с интенсивностью сигналов протонов углеводной (сахаридной) части образца. При этом доля белковой части была оценена менее чем в 40%. Исходя из того, что область. от 4,4 до 4,9 миллионных долей связана с /Ь-связями в сахаридной части образца, а область от 4,9 до 5,4 миллионных долей связана с ч-связями, удалось определить, что их отношение, т.е. отношение числа fc-связей к числу d. -связей в полисахаридной части гликопротеина варьируется от 85/15 до 40/60. Молекулярный вес азотсодержащего полиса}сарида, измеренный методом ультрацентрифугирования, варьируют , для различных образцов исслед емого вещества в диапащоне от до 300000 . Испытания азотсодержащего полисахарида на острую токсичность проводят на мышах линии ICR-ЗСЬ, имеющих возраст от 4 до 5 недель и весящих от 21 до 24 граммов, и на крысах линии Донриу, имеющих возраст от 4 о 5 недель и весящих от 100 до 150 граммов. Азотсодержащий полисахарид растворяют в физиологическом солевом растворе и вйодят животным внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно и иерорально. Общие симптомы воздейс вия вещества на подопытных животных гибель животных и изменение их вес наблюдают в течение 7 дней, после чего животных забивают и проводят аутопсию (вскрытие трупов). В резу тате проведенных испытаний не было зафиксировано ни одного случая гибе |ли животных, ни на крысах, ни на м ШАх, даже при введении им самой высокой дозы из тех, что показаны на приведенной ниже таблице 1. В табл. 1 представлены вводимые дозы азотсодержащего полисахарида. Таблица 1300 1300 Внутривенный 5000 5000 Подкожный Внутрибрюишнный 5000 5000 Пероральный 20000 2000 Внутривенный 600 600 Подкожный 5000 5000 Внутрибрюшинный 5000 5000 Пероральный 20000 2000 К числу антибиотиков, которые пр являют свое действие против резистентных к лекарственных препаратам бактерий в комбинации с азотсодержа щим полисахаридом, относятся , антибиотики, вьщеленные из плесеней, пл невых грибов, бактерий, актиномицетов и других микроорганизмов. Типич ные примеры таких антибиотиков пере числены ниже: Пенициллин &(ниже он сокращенн обозначен как PG) Стрептомицин (SM) Канамицин (КМ) Хлорамфеникол (СР) Тетрациклин (,ТС) Эритромицин (ЕМ) Аминобензилпенициллин (АВРС) Цефалоридин (СЕ) колистин (CER) Эффект, вызываемый азотсодержащим полисахаридом, состоит в промотировании (стимулировании) чувствительности к лекарствам у следующих резистентных к лекарственным препаратам (антибиотикам) бактерий: Es che г i ch i а со 1 i Streptococcus faecalis Stcephy1ococcus aureus tnterobacter aerogenes Salmonella enteritides Shigella Sonnei Klebsiella Ptoreus mirabilis Pseu domona ч . r i no sa Действие азотсодержащего полисахарида по стимулированию чувствительности к лекарствам у резистентных к антибиотикам штаммов бактерий подтверждено следующим образом. Резистентные к антибиотикам штаммы бактерий получены с помощью метода, описанного ниже, при выращивании культуры в градиентной чашке (в чашке Петри с концентрационным градиентом -соответствующего антибиотика ). Чашки Петри с агаровой средой и с концентрационным градиентом лекарсвенного вещества в диапазоне от 10 до 100 микрограмм/мл подготавливают надлежащим образом и используют для инокуляции бактерий каждого штамма методами штриховой разводки или мазка. Эти чашки инкубируют при 37°С в течение нескольких дней и колонии бактерий, сформировавшиеся в области высокой концентрации антибиотика, отделяют и снова инокулируют аналогичным образом в другие чашки. Подобную операцию повторяют несколько раз с целью получения бактериальных штаммов, резистентных к cooтвeтcтвyJOщим лекарственным веществам (антибиотикам ). Лекарственную чувствительность штаммов, резистентных к антибиотикам, и первоначальных штаммов тех же бактерий (чувствительных штаммов) сравнивают путем нахождения минимальной ингибирующей концентрации, т.е. минимальной концентрации соответствующего лекарственного соединения, ингибирующей рост бактерий ( чиже эта величина сокращенно обозначена как МИК) . Были приготовлены двойные разбавленные системы каждого лекарства, которые смешивают с агаровой средой для вливаний с целью подготовки чашек с агаровой средой. Затем отбирают петелькой образец каждого штамма, который культивируют при 37°С на Трипто-соевом бульоне в течение 18 ч, и наносят мазком на каждую чашку. После культивирования в течение 18 ч при температуре 37°С в каждой чашке проверяют степень роста инокулированного бактериального штамма. Для того, чтобы увидеть, насколько изменяется минимальная ингибирующая концентрация Смик) для каждого резистентного штаг1ма при комбинированном использовании полисахарида и соответствующих антибиотиков (тех, которые перестали действовать на определенные бактериальные штаммы), проводят процедуру, аналогичную вышеописанной, с тем исключением, что в системы добавляют, с целью получения соответствующих комбинаций, от 10 до 1000 микрограммов/мл азотсоержащего полисахарида, и величину ИК определяют в соответствии с вышеупомянутым методом, основанном на использовании чашек с агаровой средой и концентрационным градиентом антибиотиков.

При этом наблюдается отчетливо выраженный эффект - величина минимальной ингибирующей концентрации СМИК) уменьшалась в результате прибавления азотсодержащего полисахарида по крайней мере на половину по сравнению с уровнем, который фиксировался до прибавления, или даже еще ниже. Количество прибавляемого азотсодержащего полисахарида состав ляет более 10 микрограммов/мл, а в предпочтительном варианте - более 100 микрограммов/мл. Величину рН среды поддерживают при этом на уровне 7,2-0,1 с тем, чтобы на определяемую величину МИК не оказывало влияние рН среды. Кроме того, используя метод культивирования в условиях разбавления агаровой среды, азотсодержащий полисахарид сам по себе не обладает антибактериальной активностью против бактериальных штаммов, отобранных для проведения испытаний Терапевтический тест по воздействию на инфекционные заболевания проводят следующим образом. Подопытной мыши вводят внутрибрюшинно, с целью заражения, 1x10 клеток лекарственнорезистентных бактерий. Через 1-3 ч после этого мьошам вводят либо внутрибрюшинно, либо перорально от 10 до 1000 миллиграммов на килограмм веса тела мыши соответствующего лекарства и от 1 до 10 миллиграммов/кг азотсодержащего полисахарида Наблюдение за подопытными животными продолжают в течение 7 дней после введения с целью изучения их выживаемости и оценки эффективности действия азотсодержащего полисахарида. Было обнаружено, что эффективная доза вещества настоящего изобретения в предпочтительном варианте составляет более 1о мг/кг при внутрибрюшинном введении, и более 100 мг на килограм при пероральном введении. Это было выше, чем 40%.

Азотсодержащий полисахарид способен усиливать терапевтический (лечебный) эффект лекарственных препаратов не толькр в опытах in vitrojHO также и в химиотерапии инфекционных заболеваний, т.е. в опытах in vivo с рядом резистентных штаммов болезнетворных бактерий.

Азотсодержащий полисахарид проявляет также чрезвычайно низкую острую токсичность и может вводиться в организм различными путями, в частности посредством внутрибрюшинных инъекций, путем подкожного введения, пероральным путем и ректальным путем (через прямую кишку). Таким образом, азотсодержащий полисахарид может быть смешан с антибиотиком пр

проведении курса лечения этим лекарственным препаратом или же может вводиться в организм отдельно.

Когда азотсодержащий полисахарид предполагается вводить пероральным путем и его оформляют в виде таблеток гранул, порошков, капсул и других лекарственных форм для перорального введения, рецептура любого такого препарата может содержать различные добаки того типа, которые обычно используются при получении лекарственных препаратов и, в частности связующий агент, эксципиент С воспринимающее средство), смазывающее вещество ( замасливатель), дезинтегрирующий агент, смачивающий агент и т.д. Когда азотсодержащий полисахарид используется в виде жидкости для перорального введения, он может быть приготовлен в виде жидкого лекарственного средства для внутреннего применения, такого, например, как взбалтываемая микстура, суспензия, эмульсия, сироп и т.д., или же может быть получен в виде сухого продукта,.который подвергается растворению непосредственно перед использованием. Такие жидкие препараты могут также содержать в своем составе различные добавки и/или консерванты того типа, который обь1чно используется при получении лекарственных препаратов. Растворы для инъекций могут содержать в качестве добавок вещества-стабилизаторы, буферные (забуферивающие) вещества, консерванты, вещества для создания изотоничности раствора и т.п. Такие растворы для инъекций могут быть расфасованы в ампулы однократного использова ния, рассчитанные на введение определенной дозы активного ингредиента за один раз или во флаконы содержащие не -одну, а несколько доз препарата. Кроме того, вышеупомянутые композиции (рецептуры) могут выпускаться в виде водного раствора и или суспензии, а также в виде раствора или эмульсии в масляном или водном разбавителе при условии, что активный компонент может быть в виде порошка, который растворяется в таком разбавителе, например, в стерилизованной непирогенной воде, непосредственно перед использованием. В случае, когда полисахарид используется в виде мази или средства для втирания, он может содержать соответствующую масляную или жировую основу, эмульсивную основу, водорастворимую основу,, консервант и другие подобные вещества и/или добавки.

Пример. Приготавливают жидкую питательную среду следующего состава, г:

Пептон 5

Дрожжевой экстракт 3

,3

К2.НРО/4.0,3 .SO,0,3 Глюкоза50 ВодаДо 1 литра рН:б , О Аликвоту этой среды объемом 150 миллилитров вводят в каждую из 100 конических колб емкостью 1 литр, и после закупорки каждой колбы ватной пробкой жидкую среду подвергают сте рилизации в течение 30 мин при 120 и затем вносят в каждую колбу (инок лируют )посевной материал - отдельн культивированнный на скошенном агар мицелий базодиомицета Coriolus versicolor (Фр.), штамм Quel СМ-105, после.чего осуществляют стационарну культивацию инокулята в течение 20-дневного периода при температуре диапазоне от 25 до . Полученный таким образом культуральный шламм (бульон высушивают в барабанной су шилке, в результате чего получают 451 грамм сухого продукта. 150 грамм этого сухого продукта измельчают и экстрагируют 0,1 н раствором гидро окиси натрия при температуре 95-98°С при обычном давлении, в течение 3ч используя для этой цели экстрактор из нержавеющей стали. Полученный та ким образом щелочный экстракт нейтрализуют, подвергают фильтрации и п лученный фильтрат концентрируют затем до остаточного объема, равного 500 миллилитрам. Этот концентрирова ный раствор помещают затем в целлофановый мешочек и подвергают диализу против проточной воды в течение 90 ч Полученный диализат концентрирую при пониженном давлении и концентри рованный раствор подвергают затем, распылительной сушке, в результате, которой получают 19,5 г порошкообра ного продукта. Для изучения свойств этого порошк образного продукта небольшую его порцию подвергают элементарному анализу с использованием С, Н, N-анализатора (CHN-COCORDER), в результате чего найдено, что в состав вещества входит 42,1% углерода, 6,0% водорода и 5,8% азота. Определение удельного оптического вращения образца получен ного продукта производят для О,25%ного водного раствора этого вещества с использованием поляриметра VANAKO -OR-50. Измерения показали, что удельное оптическое вращение этого продукта равняется +12. Для того, чтобы узнать углеводный (сахаридный) состав этого продукта, образец весом 10 миллиграммов прибавляют к 3%-ному метанольному раствору хлористоводородной кислоты и метанолиз проводят в течение 16 ч пр температуре . После нейтрализации соляной кислоты карбонатом серебра реакционную смесь профильтровывают при комнаткой температуре и полученный фильтрат сначала концентрируют, а затем упаривают досуха. Полученный при этом твердый продукт растворяют в 0,5 миллилитрах пиридина, к раствору прибавляют 0,2 милли;питра гексаметилдисилазана и 0,3 милг лилитра триметилхлорсилана и реакционную смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 30 мин для завершения реакции триметилсилилирования. Продукт растворяют затем в хлороформе, и после отмывки избытка реагента и дегидратации фильтрат упаривают досуха. Затем этот прюдукт растворяют в четыреххлористом углероде и подвергают анализу методом газо-жидкостной хроматографии. ГЖХ-анализ показал, что продукт состоит из 70,5% глюкозы, 3,8% галактозы, 10,3% маннозы, 5,4% ксилозы и 10,0% фукозы. Для определения аминокислотного состава белковой части порошкообразного продукта его образец подвергают аминокислотному анализу в соответствии со стандартным методом Мура и Штейна. В результате аминокислотного анализа получают следующий состав: 15% аспарагиновой кислоты, 8% треонина, 6% серина, 14% глутаминовой кислоты, 4% пролина, 8% глицина, 10% аланина, 4% изолейцина, 6% лейцина, 1% тирозина, 4% фанилаланина, 2% триптофана, 2% лизина, 3% аргинина, 4% аммиака и 1% N-глюкозамина, а также следы гистидина. Для исследования продукта методом ЯМР-спектроскопии в качестве растворителя используют тяжел17ю воду, а в качестве внутреннего стандарта 2,2-диметил-2-силанопентан-5-сульфонат, причем для устранения любого возможного влияния на результаты анализа остаточного количества легкой воды, содержащегося в тяжелой воде, используют величины, которые подверглись коррекции, проделанной на основе предполагаемой кривой Лоренца. В этих условиях отношение доли углеводной части вещества к его белковой части было.определено, исходя из допущения, что поглощение в области 0,5-2,5 миллионных долей обусловлено протонами белковой части продукта, тогда как поглощение в области от 2,5 до 6,0 миллионных долей относится к протонам углеводной (сахаридной) части продукта. Полученное отношение углеводной части к белковой равно 89:11. Кроме того, полоса поглощения 4,14,9 миллионных долей связана с -связями сахаридной части, а полоса поглощения в области 4,9-6,0 миллионных долей связана с ч-связями сахарида, анализируя ЯМР-спектр продукта, определяют также отношение долиfe-связей к доле д -свчзей в полисахаридной части продукта. Это отношение (5/г/.) равно 65:35. Молекулярный вес исследуемого продукта определяют посредством ультрацентрифугирования его раствора, причем измерение проводят с использованием седиментационно-равновесного мерода и синтетической граничной модепи картинки). Для этой цели используют интерференционную оптическую сис тему, причем измерения проводят в следующих условиях: концентрация образца в растворе 0,3%; растворитель М/10 KCti температура 25°С; столбик жидкости высотой 1,7 миллиметра; скорость вращения ротора 22000 об./ми продолжительность измерения 5 ч. Полученное значение среднего молекулярного веса вещества равно 100000. Испытания продукта на эффективность стимулирования лекарственной чувствительности у резистентных к лекарственным препаратам бактерий, которые, в частности, приобретают резистентность к антибиотикам, проводят следующим образом. Образцы резистентных к лекарственным препаратам бактерий получают согласно вышеупомянутой методике культивирования бактерий в чашках с концентрационным градиентом антибиотиков в агаровой среде при использовании бактерий Staphy1OCOCCUS aureus. Strep tococcus faecaiis, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumonia), Pseudomonas aeruginosa. Минимальные ингибирующие концентрации {МИК) антибиотиков для исходных бактерий и тех бактерий, которые приобрели резистентность (устойчивость) к лекарствам, приведены в, табл. 2. Таблица 2 Бактерии Продолжение табл. 2 En te robacte r aerogenes Sa1moneI 1 a enteritidisShigella sonnei Klebs i el 1 a pneumon i ae Proteus mirabi 1 i S Pseudomonas aeru-CL g i nosa

coll PC12,5100

SM3,1lOOC

KM6,3200

CP1,650

TC3,125

CER3,125

EM100

Величины минимальной ингибирующей концентрации (МИК) пенициллина (РС) вычислены, исходя из допущения, что 1,667 Е (единицы ) 1 мг.

Величины МИК цефалоридина CCL) вычислены, исходя из допущения, что 30000 Е (единиц) 1 мг.

Для того, чтобы увидеть изменение величины минимальной ингибирующей концентрации (МИК) для соответствующих, резистентных к лекарственным препаратам штаммов бактерий при совместном использовании предлагаемого вещества и различных антибиотиков (те которые использовались для выработки резистентности у бактерий), азотсодержащий полисахарид прибавляют в культуральную среду в количествах от 10 до 1000 микрограммов/мл и величины МИК получают в соответствии с методом культивирования в чашках с агаровой средой. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Staphy1ococcus

aureus

PC-resistant

CP- t reptococcus faeca1i s TC-resistant

Escherlchia co

KM 1000 100

CP 100 12,5

TC 100 . 12,5

Klebsiel la pneumon i a 1 SM-res i stant

CP 1000 50

двРС 10 25

CL 1000 200

я. Вещество настоящего изобретения

прибавляли в культуральную среду. Вещество настоящего изобретения не прибавляли в культуральную .

Таблица

1,6

г/мл 12,5 25 6,3 3,2 25 12,5 3,2

6,3

25

12,5

3,2 6,3

12,5

12,5

100

Пример 2. Испытания по выяв 1ению терапевтического (лечебного) воздействия на инфекционные эаболева ния проводят на пяти группах самцов

мьоией линии ICR-ICL (каждый из которых весил 22il грамм), причем каждая группа состоит из 10 мышей, при использовании резистентного к пенициллину G штамма бактерий Streptococcus, полученного в примере 1.Этот резистентный к пенициллину G-штамм aureus, который культивировался на Трипто-соевой агаровой среде при температуре 37°С в течение 18 ч, суспендируют в Трипто-соевом бульоне, содержащем 5% муцина, и 0,25 миллилитра такой суспензии вводят fинокулируют ) внутрибрюшинно каждой подопытной мыши. Заражение регулируют таким образом, чтобы каждая мышь получала в инокуляте 5x10 клеток бактерий. Через два часа после заражения (инокуляции ) мышам вводят внутрибрюшинно пенициллин Q- в дозе 2,5 X 10 единиц/кг веса тела мышей и 5 X 10 Е/кг соответственно. Одновременно мышам вводят внутрибрюшинно азотсодержащий полисахарид, полученный в соответствии с методикой примера 1, в дозе, равной 100 мг/кг веса тела. Обработанные таким образом мыши находятся под постоянным наблюдением каждый день в течение 7 дней после введения с целью определения выживаемости зараженных мышей. Комбинированное использование антибиотика и азотсодержащего полисахарида (NP/) может существенно улуч1иить лечебное действие пенициллина G- за счет повышения чувствительности к пенициллину С} резистентных к нему in vivo бактерий.

Пример 3. Аналогичный тест на терапевтическую эффективность в лечении инфекционных заболеваний проведен на, пяти группах самцов мышей линии ICR-ICL (каждая мышка весит грамм, причем каждая групп подопытных животных состоит из 10 мшей) при использовании резистентного к тетрациклину штамма Е.соП и азотсодержащего полисахарида, полученных в соответствии с методикой, описанной в примере 1. Для заражения каждой мышки вводят внутрибрюшинно 0,25 мл Трипто-соевой бульонной суспензии, включающей 5% муцина резистентных к тетрациклину бактери приготовленной как описано в примере 1. Инокулирование регулируют таким образом, чтобы каждая мъаика полчила внутрибрюшинно 5 к 10 клеток бактерий. Через 2 ч после инокуляции мышам вводят перорально тетрациклин в дозах 80 мг/кг веса тела и 160 мг/кг соответственно. Одновремено мышам вводят пероральным путем азотсодержащий полисахарид в дозе 100 миллиграмм/кг. Комбинированное

использование азотсодержащего полисахарида и тетрациклина способно вызывать значительно более .высокий лечебный эффект, чем использование одного тетрациклина. Кроме того, поскольку практически один и тот же эффект может быть достигнут как при пероральном введении вещества, так и при внутрибрюшинном его введении, вещество может найти самое широкое применение вследствие его высокой эффективности.

Пример 4. Резистентный к пенициллину G штам Staphy1OCOCCUS aureus инокулируют пяти группам (по 10 мышей в группе) мышей-самцов линии ICR-ICL, каждый из которых и 1eeт вес 2211 грамм, с нагрузкой 5 х 10® клеток на каждую подопытную мьплку, следуя методике примера 2. После этого четырем группам мышей вводят внутрибрюшинно 2,5 X Ю Е/кг пенициллина G и соответственно 1, 10, 100 и 1000 мг/кг азотсодержащего полисахарида (того же, что используют в примере 1). Ежедневные наблюдения за подопытными мышами велись в течение 7 дней после введения указанных препаратов .

Пример 5. Осуществляют аналогичный опыт по лечению инфекционных заболеваний с использованием б групп из самцов-мышей ICR-ICL.причем каждая группа, состоящая из 10 мышей, инокулированных клетками устойчивых к тетрациклину бактерий E.Coli в количестве 5x100000000 клеток на мьппь, с использованием процедуры примера 3.

Через два часа после инокуляции вводят тетрациклин в дозе 80 мг на .кг веса тела 1«1ыши с одновременным оральным введением азотсодержащего полисахарида, используемого в примере 1, в соответствуюодих дозах О, 10,100, 1000 и 10000 мг/кг, при этом шестая группа была контрольной. Обследование мышей проводилось ежедневно до 7-го дня.

Пример 6. Штамм СМ-151 базидиомицета Coriolus hirsutus (Фр.) (Juel (Perm . Res . I ns t . Depos i t N-FERM-P 2711) культивирутот, как в примере 1, и затем экстрагируют и очищают в соответствии с аналогичной методикой, в результате чего получают 17,5 грамма порошкообразного вещества. Свойства этого вещества следующие:

Элементарный анализ: 43,7% углерода; 6,4% водорода и 5,5% азота. 2

Удельное оптическое вращение :о(/. +30°.°

Углеводный состав: 79% глюкозы, 15% маннозы, 2% ксилозы, 4% галактозы и следы фукозы.

Содержание белка в веществе: .

Отношение сахаридных СБЯзги.Д ) : : 71/29. 5 Средний молекулярный -с : К-ГИн: .

Аминокислотный состав белковой части: 15% аспарагиновой кислоты; 9% треонина, 5% серина, 14% глутаминово кислоты, 6% пролина, 9% глицина, 9% аланина, 7% валина, 1% метионина, 5% изолейцина, 6% лейцина, 2% триптофана, 4% фенилаланина, 2% лизина, 3% аргинина, 2% аммиака, 1% глюкозамина и следовые количества цистина, тирозина и гистидина.

Полученное таким образом вещество имеющее вышеупомянутые характеристики, используют для проведения следующего эксперимента.

По аналогии с примером 1 получают резистентный к хлорамфениколу штамм Salmonella enteritidis. Затем 0,25 миллилитра суспензии вьдиеупомянутых хлорамфеникол-резистентных бактерий в Трипто-соевом бульоне (см. пример включающем 5% муцина, инокулируют внутрибрюшинно пяти группам мы1ией (каждой мышке-), причем каждая из эти групп состоит из 10.животных. Каждой подопытной МЕЛШке вводят 1 X 10° клеток. Через 25 ч после инокуляции мышам вводят внутрибрюшинно по 50 миллиграмм/кг хлорамфеникола. Мышам другой группы помимо этого вводят перорально азотсодержащий полисахарид в дозе 500 мг/кг. В группе, где мышкам вводили один хлорамфеникол, выживаемость через 5 дней после введения составила 40%, тогда как в группе, где антибиотик давали в комбинации с азотсодержащим полисахаридом, выживаемость оказалась на Уровн 80%.

Пример 7. По методике примера 1 получают резистентный к стрептомицину штс1ММ Klebsiella pneumonial 0,25 миллилитра Трипто-соевого бульона (см. пример 2), содержащего 5% муцина и указанные резистентные бактерии, инокулируют внутрибрюшинно подопытным мышам, образующим 2 группы по 10 мышей в каждой, выдерживая норму порядка 1 х 10 клеток на каждую мышку. Через 3 ч после этой инокуляции 1иышам вводят внутрибрюшинно по 100 мг/кг стрептомицина. Мышам одной группы вводят кроме того по 120 мг/кг азотсодержащего полисахарида, полученного в соответствии с методикой, описанной в примере 6, используя внутрибрюшинный путь введеНИН. Через 6 дней после введения выживаемость мышей в группе, где животным вводили один стрептомицин, составила 50%, тогда как в группе, где мышам вводили стрептомицин в комбинации с полисахаридом, выживаемость оказалась намного выше (около 80%),

Пример 8. О,25 мл суспензии колистин-резистентных бактерий Pseudomonas aeruginesa,культивированных в соответствии с методикой, аналогичной описанной в примере 1, в Трип0то-соевом бульоне (см. пример 2), содержащем 5% муцина, инокулируют внутЬибрюшинно подопытным мышам-самцам линии ICR - ICR, каждая весом 22tl грамм, распределенным в 2 груп5пы по 10 мышей в каждой, вьщерживая норму введения 1 х 10 клеток на каждую мышку. Через 2 ч после инокуляции мышам вводят внутрибрюшинно антибиотик колистин 190 мг/кг (1 микрограмм 30 единицам). Помимо

0 этого мышам одной группы вводят также перорально азотсодержащий полисахарид, полученный по методике, аналогичной описанной в примере 6, в дозе 1500 мг/ /кг. Через 6 дней после введения вы5живаемость мьпиой в группе, где им вводили один Kt.vnистин, составила 40%, тогда как в группе, где колистин применялся в комбинации с предлагаемым веществом, выживаемость мьлией оказа0лась равной 70%.

Предлагаемый способ позволяет получить азотсодержащий полисахарид, промотирующий чувствительность к лекарствам у бактерий, устойчивых к ан5тиьиотикам.

Форрлула изобретения

0 чувствительность к лекарствам у бактерий,, устойчивых к антибиотикам, отличающийся том, что штамм СМ-105 Coriolus versi color (Fr) .Quel или штамм СМ-151 Coriolus

5 hirsutus (Fr) Quel выращивают в питательной среде, отделяют мицелий, высушивают его и измельчают и экстрагируют горячим водным растворителем.

0

2.Способ по п. 1, отличаю щ и и с я тем, что в качестве водного растворителя используют 0,1 н раствор гидроокиси натрия.