Питательная среда для выявления сальмонелл Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/10 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к плотным дифференциально- диагностическим средам, используемым для выделения сальмонелл.

Существующие дифференциально-диагностические среды обладают недостаточными селективными свойствами по отношению к сальмонеллам. Имеющиеся в практике среды дают неплохие результаты при работе с чистыми культурами, В процессе работы при выделении сальмонелл, как правило, приходится работать со смешанными культурами. При росте различных мик- роорганизмов на этих средах (Эндо, Левина, Плоскирева) культуры трудно дифференцируются.

Состав среды Левина, мас.%: Лактоза2,0

Метиленовый синий 0,01 Эозин желтый0,03

Калий фосфорно-кислый двузамещенный0,2

Питательный агарОстальное

. Сальмонеллы на этой среде растут в виде прозрачных, бесцветных или слаборозового оттенка колоний. Ешерихии образуют синие или черные колонии, протей - оранжевого оттенка колонии. Смесь этих культур трудно дифференцируются. Кроме того, недостатком среды является низкая селективность недостаточно задерживается рост посторонней микрофлоры.

х| ел сю о

XI

о

Известна селективная среда висмут - сульфитный агар состава, мае %

Мясной экстракт0,5

Пептон1,0

Глюкоза0,5

Натрий фосфорно-кислый

двузамещенный0,4

Сульфат железа0,3

Сульфат висмута 0,8

Бриллиантовый зеленый 0,0025

Агар„-- - 2,0

Водаt $ Остальное

Среда, разлитая в чзижи Петри, хранится при 4+2°С и используется не ранее 24 ч и не позже 5 дн.

Недостатком этой среды является то, что не все виды сальмонелл дают на ней характерные колонии черного цвета с металлическом блеском и почернение среды под колониями В то же время отдельные культуры не относящиеся к роду сальмонелла, дают колонии на этой среде, схожие с колониями сальмонелл Кроме того, протей растет в Н-форме.

Наибопее близкой к изобретению является среда РЖ-65 следующего состава, мас.%:

Лактоза2,0

Калий фосфорно-кислый

двузамещенный0,3

Стерильная желчь крупного рогатого скота10,0

Питательный агар5,0

Бриллиантовый зеленый 0,002

Дистиллированная

водаОстальное

Среда разливается в пробирки. Исследуемый материал вносится в среду для дальнейшей инкубации. При работе с чистыми культурами среда обеспечивает дифферен- цировку сальмонелл от кишечной палочки. Однако при смеси этих культур результат оценки среды затруднен и зависит от количественного соотношения сальмонелл и бактерий групп кишечных палочек. Протей дает аналогичные с сальмонеллами изменения среды. При использовании среды в чашках Петри колонии сальмонелл и кишечных палочек плохо дифференцируются Оба вида растут в виде молочного цвета, мутных колоний Протей растет колониями практически одинаковыми с колониями сал&мо- нелл

Цель изобретения - улучшение диффё- ренцирующих свойств среды

Для достижения указанной цели известная среда, в состав которой входит питательный агар, калий фосфорно-кислый двузамещенный, лактоза, стерильная желчь крупного рогатого скота индикатор и ДИС;

тиллированная вода, дополнительно содержит сахарозу, а в качестве индикатора - трифенилтетразолиум хлористый и малахитовый зеленый при следующем соотноше- нии компонентов, мас.%

Питательный агар3,9-4,5

Калий фосфорно-кислый двузамещенный0,25-0,35

Лактоза1,0-2,0

0 Сахароза1,0-2,0

Стерильная желчь крупного рогатого скота 5,0-15,0 Малахитовый зеленый 0,0025-0,0035 Трифенилтетразолиум 5 хлористый0,002-0,004

Дистилированная

водаОстальное

Сопоставительный анализ предложенного состава среды с известной средой (про- 0 тотипом) показывает, что предложенный состав отличается введением в него в качестве индикатора трифенилтетразолиума хлористого и спиртового раствора малахитового зеленого, а также сахарозы. 5Для экспериментальной проверки

предлагаемого состава были приготовлены пять смесей ингредиентов, три из которых показали оптимальные результаты (см табл. 1)

0 В состав пяти вариантов сред входили соответственно, в мае %:

I II III IV V Питательный

агар3,8 3,9 4,0 4.5 5,0

5 Калий фосфорнокислый двузамещенный0,1 0,25 0,3 0,35 0,4 Лактоза0,4 1,0 1,5 2,0 3,0 Сахароза0,4 1,0 15 2,0 3,0 0 Стерильная желчь крупного рогатого

скота2,0 5,0 10,0 15,020,0

Малахитовый

зеленый0,001 0,003 0,01

5 0,0025 0,0035

Трифенилтетразолиум хлористый0,001 0,003 0,02

0,002 0,004 0 Дистиллированная водаОс- Ос- Ос- Ос Осталь-таль- таль- таль- таль- ное ное ное ное ное При приготовлении сред использовали 5 1%-ный спиртовый раствор малахитового зеленого, 0,4%-ный водный раствор трифенилтетразолиума хлористого, калий фосфорно-кислый двузамещенный, лактозу, сахарозу, желчь крупного рогатого скота, 1 %-ный спиртовый раствор малахитового

зеленого, питательный агар. Ингредиенты растворяли последовательно после полного растворения предыдущего при подогреве, доводили до кипения. Автоклавировали под текучим паром (100°С) 15 мин. Цвет среды после автоклавирования зеленый. Посевы инкубировали при 24-48 ч, рН среды после автоклавирования находится в пределах 7,0- 7,2.

В табл. 2 представлены данные о характере роста бактериальных культур на испытуемых вариантах сред.

Бактериальные культуры использовались после оживления - четырехкратного ежесуточного пассажирования на мясопеп- тонном бульоне.

В качестве примера роста лактозофер- ментирующих микроорганизмов использовали Е. coli 675, в качестве примера роста сахарозоферментирующих микроорганизмов - Proteus vulgaris.

Рост культур проявляется через 16-18 ч, но интенсивную окраску колонии приобретают через 22-26 ч. На всех вариантах сред культуры растут в S-форме, рост культур Staph, luteus, Micr. lysodeicticus, Вас. cereus, Вас. sudtilis, Staph. aureus, Str. fecium полностью задерживается. Свои свойства среда при хранении при комнатной температуре, разлитая в колбы по 200 мл, сохраняет в течение 1.5 мес, разлитой в чашки Петри - 14 дн (срок исследования).

Оптимальные результаты получены при использовании 2, 3 и 4 вариантов сред. Колонии протея на этих средах темно-голубого цвета, ровные, блестящие,.влажные. Колонии кишечных палочек голубого цвета, ровные, блестящие, влажные. Эти две культуры не изменяют цвет среды. Колонии сальмонелл коричневые различных оттенков. Центральная часть колоний S. gallinarum- pullorum может быть окрашена в вишневый цвет. Культуры сальмонелл изменяют цвет среды вокруг колоний с зеленого до светло- коричневого.

В первом варианте среды колонии кишечных палочек серые с коричневым или слабым зеленым оттенком. Цвет среды вокруг колоний изменен от светло-зеленого до серо-коричневого. Колонии протея -серые, бледно-голубые, Колонии сальмонелл схожи по цвету и характеру колоний с колониями кишечных палочек, поэтому визуальная дифференциация этих культур затруднена. Следовательно, содержание компонентов в этом варианте среды следует считать запредельным,

В 5-м варианте среды происходит значительное угнетение культур, в том числе

сальмонелл, особенно S. gailinarum- pullorum, поэтому содержание компонентов в этом варианте среды следует считать запредельным,

Оптимальное содержание малахитового зеленого в этих средах находится в пределах 0,0025-0,0035 мас.%. При уменьшении концентрации малахитового зеленого ниже 0,0025 мае. % колонии кишечных палочек окрашиваются в серо-коричневый цвет, колонии протея - бледно-голубой. Это

0 затрудняет визуальную дифференциацию этих культур от колоний сальмонелл. При увеличении концентрации малахитового зеленого больше 0,0035 мае. % происходит значительное угнетение культур, в том числе

5 сальмонелл. Поэтому концентрации малахитового зеленого меньше 0,0025 мае. % и больше 0,0035 мае. % следует считать запредельными.

Оптимальное содержание лактозы (1,00 2,0 мас.%) обеспечивает голубую окраску культур, ферментирующих лактозу. При содержании лактозы 0,4 мас.% и ниже колонии кишечных палочек серые с коричневым оттенком. Это затрудняет визуальную диф5 ференциацию этих культур от колоний сальмонелл. Поэтому концентрацию лактозы меньше 1,0 мае. % следует считать запредельным. Увеличение содержания лактозы более 2,0 мае. % считается нецелесообраз0 ным, так как это не приводит к изменению окраски колоний.

Оптимальное содержание сахарозы находится в пределах 1,0-2.0 мае %, который позволяет определить наличие сахарозо5 ферментирующих свойств исследуемых культур и обеспечивает голубую окраску их колоний. При уменьшении сахарозы меньше 1,0 мае. % колонии протея приобретают более бледно-голубую окраску. Это затруд0 няет визуальную дифференциацию этих культур от колоний сальмонелл. Поэтому концентрацию сахарозы менее 1,0 мае. % следует считать запредельной. Увеличение содержания сахарозы более 2,0 мае. %

5 считается нецелесообразным, так как это не приводит к изменению окраски колоний.

Оптимальное содержание трифенилтет- разолиума хлористого находится в пределах

0 0,002-0,004 мас.%, который обеспечивает окраску колоний сальмонелл в коричневый цвет. Уменьшение содержания трифенил- тетразолиума хлористого ниже 0,002 мае. % приводит к более бледной окраске колоний

5 сальмонелл, которая все больше приобретает Серый цвет и теряет коричневый оттенок. Увеличение содержания трифенилтетразо- лиума хлористого более 0,004 мае. % приводит к значительному ингибированию культур, особенно S. gallinarum-pollorum Следовательно, концентрации трифенилтетразолиума хлористого меньше 0,002 и больше 0,004 мае. % являются запредельными

Оптимальное содержание питательного агара 3,9-4.5 мае % При уменьшении содержания ниже 3,9 мае % среда получается недостаточно плотной, что создает определенное неудобство при посеве исследуемо- го материала Увеличение содержания питательного агара более 4,5 мае. % приводит к получению очень плотной среды Это требует большего времени при разогреве среды и увеличивает риск разложения угле- родов при нагревании Поэтому концентрации питательного агара меньше 3,9 и более 4,5 мае % являются запредельными.

Оптимальное содержание калия фос- форно-кислого двузамещенного находится в пределах 0,25-0,35 мае %. При уменьшении его содержания менее 0,25 мае % происходит уменьшение буферности среды. При увеличении содержания калия фосфор- но-кислого двузамещенного более 0,35 мае % изменений в окраске и характере роста колоний не происходит Поэтому концентрации калия фосфорно-кислого двузамещенного меньше 0,25 и более 0,35 мае % являются запредельными.

Оптимальное содержание стерильной желчи крупного рогатого скота находится в пределах 5,0-15,0 мае % Уменьшение содержания стерильной желчи крупного рогатого скота меньше 5,0 мае % приводит к уменьшению ингибиторных свойств среды по отношению к другим микроорганизмам. Увеличение содержания стерильной желчи крупного рогатого скота с 15.0 до 20,0 мае % приводит к увеличению ингибиторных свойств среды и задержке роста S. gallinarum-pollorum. Поэтому концентрации стерильной желчи крупного рогатого скота меньше 5,0 и более 150 мае % являются запредельными.

Рост культур сальмонелл, кишечных палочек, протея проявляется через 16-18 ч. Интенсивную окраску колонии приобретают через 22-26 ч Колонии сальмонелл имеют коричневую окраску, колонии Е coli, Proteus vulgaris голубые, возможен зеленый оттенок Рост других микроорганизмов (Staph aureus Лос , Staph aureus 100, Str fecium, Вас luteus, Micr lysodeicticus, Вас subtilis, Вас cereus) полностью задерживается (посевы инкубировались при 37+1 °С в течение 72 ч).

Возможно применение среды путем прямого посева исследуемого материала без предварительного посева на жидкие селективные среды накопления. Это позволяет сократить сроки исследования на сальмонеллы с 5-ти до 3-х суток

Формула изобретения Питательная среда для выявления сальмонелл, содержащая питательный агар, калий фосфорно-кислый двузамещенный, лактозу, стерильную желчь крупного рогатого скота, индикатор и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью улучшения дифференцирующих свойств среды, она дополнительно содержит сахарозу, а в качестве индикатора - трифенил- тетразолиум хлористый и малахитовый зеленый при следующем соотношении компонентов, мае. %

Питательный агар3,9-4,5

Калий фосфорно-кислый двузамещенный0,25-0,35

Лактоза Сахароза

Стерильная желчь крупного рогатого скота Малахитовый зеленый Трифенилтетразолиум хлористый Дистиллированная вода

1,00-2,00 1,00-2,00

5,0-15,0 0,0025-0,0035

0,002-0,004 Остальное

Таблица 1

Область применения: микробиология, плотная дифференциально-диагностическая среда, выделение сальмонелл. Среда содержит дистиллированную воду, лэкгозу, калий фосфорно-кислый двузамещенный, стерильную желчь крупного рогатого скота, питательный агар, сахарозу, трифенилтетра- золиум хлористый и малахитовый зеленый при следующем соотношении ингредиентов, мае. %: питательный агар 3,9-4,5; калий фосфорно-кислый двузамещенный 0,25- 0,35; лактоза 1,00-2,0; сахароза 1,00-2,0; стерильную желчь крупного рогатого скота 5,0-15,0; малахитовый зеленый 0,0025- 0,0035; трифенилтетразолиум хлористый 0,002-0,004; дистиллированная вода остальное. Среда обладает более высокими селективными свойствами по отношению к сальмонеллам, чем известные среды, обеспечивает визуальное отличие колоний сальмонелл от культур, ферментирующих лактозу и сахарозу 2 табл. (Л С

Состав испытуемых вариантов среды

Характер роста культуо «а испытуемых вариантах сред

Таблица