Способ получения гемпептида цитохрома С Советский патент 1992 года по МПК C07K15/22 

1/ чпрет н е о J TCJ ч биохпми 1 и

МОЖб Jb Ь/ltnOlb . РЮЛОГИИПО 1

гн«-й rev r-jritr о ч, i лаа npo.J12 Ip/И И1 п О „ -JC Jj,d Т Л РН И Я

НИГОУОЛ ЗлОд рименечие

в MGD |Ц1/ гчО 1я и иге сдизатетьскои про / i ка i atjor ьроксидазы

( „ ibj и 1 впия t Cv

дер ,djj, пз диюхи а С зскпюча

ЬГ оСTTMCr uV1Д001ИЯе

npe/-|-c и ЩРНН о ц толро а С и v с м i- у |рч и м °гтид по MOL oto ионы б еччо/хрома о рэфии гель фи i i n j u i и / -1Ыл ме с,оов i 2)

и г 0(- педпагаегюму яв яе cnuwob опнен/я гемнонзпептида Фраг1 1-га И « о ищтиь ьбяфер

Мвг |Ч L ThOt РТ 1 - ПГ ЦИ OXDOv С В

вод ov 0 н растч ое N4 -- L О г р ot г оотнпшени TI ипс, на и ц с1 Э „- 1епзт уге 3 С .Cv i- - i -.

О раСР Иве j Ю ИСТК .„f J

i а коу о е с 1го i т „ ч or с согл i ппс -1 v

ы/ю 31 Вьх е т д

/

Со не д ч, т f1 ев i JOT oii -,

ееС ел ч н v,

((1ГСП fВь coi о оиищен но L j то рог

Цепью ПГРД 3 Оit ri ас

про ие пр с TLт

гогержащил t п v ь

По г TRie- °j.r

в ве гг iт i иi

О

4

дов цитохрома С включающем операции обработки трипсином исходною продукта на основе цигохрома С с юследующей его лиофилизациеи перед операцией обработки трипсином исходного продукта на основе цитохрома С проводят осаждение цитохро- ма С из водного раствора с концентрацией 1,0-1,2 MI/мл водным раствором, содержащим 0,1-0,2 М сопи трехвалентного железа и 0,3-0,6 М йодистого натрия при этом используют соотношение раствора цитохрома С и раствора указанных солей в интервале (10-12) 1

Уменьшение концентрации циюхрома С в растворе приводит к уменьшению выхо да целевого продукта а ее верхнее предельное значение I 2 мг/мл обусловлено технологией приготовления исходного продукта - экстра/гов из тканей

Применение указанны) выше пределов концентраций солей обусловлено тем что меньшее количество осадителя как при изменении концентрации в растворе так и при использовании иных соотношений растворов цитохрома С из раствора, a при увеличении (серрх предельных значений) количества солей происходит неэффектив ный расход примененных веществ без соот- ветст вующего повышения выхода целевот продукта

Призер 1 06л клеточисго эксп ро1 5 дрожхей обогащенною /похромом С за счетулснрафильтрстьии до грации 1,0 мг/мл подкисляю, до р i 4 Ь и выпавшие Б осадок негемозые епки отделяют центрифугированием К нзлосадо (ной житкост/i добаьляютоО 1л раствора .одеожашегоО i М сульфата venss (IMj и 3 М иодида на трия Смесь выдерживают 20 .лин при -ч°Г отделяют осадок i снтрифу; ированием i промывают Bo,ic.i дня удаления остатка со лей Осадок суспензируют с 95 мл С 1 Ivi раствора гидрокарбоната аммония (рН 8 45} добавляют 6 мг грипсинг. и проводя гидролиз осадка при температуре 37°С в течение 4 ч Полученный красно-бурый раствор отделяют центрифугированием раз бавляют 20 мл дистиллированной воды л наносят на колонку (3 0 20) с г с Амберлигом iRC-50 в Н-форме рН56-60 Кгпэнк / промывают дистиллирован .,л L-OU, ем- содержащий пептид смывают % раствором г и д р о к с и д a a iv, м о н и я затем пиофилизуют Выход гемпептида составляет 87 мг Анализ гемпептида с помощью ТСХ в системе н-бутанол вода уксусная кислота (4 1 5), элек грофооегическим методом и

путем аминокислотного анализа показал соответствие полученного продукта гем-со- держащему пептиду выделенному из цитохрома С дрожжей известными способами и дал значение чистоты 89%

Пример 2 К02л экстракта цитохрома С из сердца крупного рогатого скота с концентрацией 1,2 мг/мл добавляют 20 мл раствора содержащего 0 1 М сульфата железа (III) и 0 4 М иодида натрия выдержива ют раствор при г4°С и отделяю осадок центрифугированием Полученный осадок суспензируют в 10 мт 0 1 М раствора гидро карбоната аммония 1 рипсинолизи очистку

проводят как в примере 1 После лиофили- зации получено 22 мг гемнонапептида 14- 22 с 4&4CTOTOU92 % по своим свойствам соответствующего гемнонапептиду цитох- рсмйС полученном;, iio способу прототипу

Пример 3 К (J 2 л зле: ам рн цптокро й

С из сердца крупного рогатого скита ; концентрацией 1 2 мг/мл добавпяют 20 мл раствора содержат .его 0 2 М лл зрида железа П1п и 0 6 f11 чодидс натрия черьз 2С мин осадок отде

ляют центрифугированием и проводят обработку как в примеое 2 После очистки на колонке с Амберлитом IRC 50 гемнонапептид концентрируют лиэфильным высушиванием

И ПрОЕОДЯТ ДОПОЛН11гелЫ-1 Ю С П)

мо1иыо гепь-фил1 грации на Се ,.„е G 2 ь 1 %-ног 1 рас i воре лдрс , ы ша a-if юни т 3i, од составил 19 мг i гнонапепти -. 1 ; 22 с писгоюй 96%

Предлагаем .if, гпо г г, ,е им пептидов ц то fOi г in HP г u i ,L о - т в к а ч а i в еь /. н с и г д( т а

JKCI ра« ь тканей чт d-nio ae j , j щие продолх е ibn it и ,Oc;i ni

ПО ПиЛуЧИ тПЮ 41 1C ul Ц. ) VV r -,

также упрос ип ь н i/ioit . с ки/ i , Оце-. тол чения гч.л 1пептидоь цч j fiorio i

О о р hi ; л а ч з о б п с т Р ь н я Г пособ пол нек ча i ei i иг i syp :. С включающей обиабогку цитолромг С трипсином хрома i 01 рафмческ ю пччс / 1Сяен ) С продукта norrp. iy-oijten ъ ли

оЭЦИРИ О т л И Ч а Ю Ц И И С и 01 UTO С

цепью упрощения способа сбрсгбо ке трип ;ином подвергают цитохром С осам г,-зниыи L тдным раствором ооцер-тощи 1 0 0 2 М соли трехвалентгюго железа и 0 и 6 одистого натрия из KCIпакта пр п;идного источникацитохрома Г с концен грацией по- следнего 1012 мг/мп экорак Р i г, объ РМНОМ соотношении жсграктя . зсдногг/ раст вора солей (10 12)1