6-Аминонафтали-1-сульфамиды в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного определения пептидаз Советский патент 1993 года по МПК C07C311/38 G01N33/50 C07D295/28 

Изобретение относится к химии амино- нафталинсульфокислот, а именно, к новым замещенным 6-аминонафталин-1 -сульфамидам общей формулы I .. мил

©оГ

S02NR

где RI Н, R2 СНз, С2Н5, СзН, i-СзН, С4Нэ,

i-C4Hg, t-C4Hg, CsHn, O HjC-© , или

, с2н5, или -NRIRZ -N()

-O -NG0i

в качестве детектирующих групп субстратов для флуоресцентного определения пептидаз.

Цель изобретения - изыскание в ряду аминонафталинсульфокислот новых соединений, позволяющие при использовании их в качестве детектируемых групп увеличить относительную интенсивность флуоресценции и расширить ассортимент детектируемых групп субстратов.

Цель достигается новыми 6-аминонаф- талин-1-сульфамидами общей формулы 1, синтез и физико-химические свойства которых иллюстрируется примерами.

При м е р 1. 6-Фталимидонафталин-1- пентилсульфамид.

13 мл (0,11 моль) пентиламина и 14 мл (0,1 моль) триэтиламина растворяют в 500 мл ацетона, добавляют в течение 10 мин 37,1 г (0,1 моль) 6-фталимидонафталин-1- сульфонилхлорида и перемешивают при 20°С 4 ч. Ацетон отгоняют при пониженном давлении, осадок заливают 1 л воды и через 20ч отсасывают продукт. Промывают водой, сушат; перекристаллизовывают из метанола и получают 40,9 г (выход 96%) аналитически чистого продукта с т.пл. 168-172°С.

Найдено, %: С 65,60; Н 5,28; N 6,71; S 7,18.

C23H22N2S04.

Вычислено, %: С 65,39; Н 5,25; N 6,63; S 7,59.

Ё

00

о J ел ел

со

Аналогично получают другие замещенные 6-фталимидонафталин-1- сульфамиды (табл. 1),

Пример 2. 6-Аминонафталин-1-пен- тилсульфамид,

4,23 г (0,01 моль)6-фталимидонафталин- 1-пентилсульфамида заливают 50 мл метанола, прикалывают 0,5 мл (0,01 моль) гидразин гидрата и кипятят 4,5 ч. Метанол отгоняют, остаток экстрагируют 2x20 мл ки- пящего хлороформа, экстракт упаривают и остаток перекристаллизовывают из метанола. Получают 1,86 г (выход 64%) хроматогра- фически и аналитически чистого продукта с т.пл. 87-90°C,Rf 0,60 (алуфол; хлороформ- этилацетат 1:1). ПМР-спектр ( д , м.д., ДМСО): 0,63 (СНз), 1,05 (СН2). 2,71 (СН2).

Найдено, %: С 61,72; Н 6,86; N 9,40; S 10,92.

Ci5H2oN2S02.

Вычислено, %: С 61,62; Н 6,89; N 9,58; S 10,96.

Аналогично получают другие замещенные 6-аминонафталин-1-сульфамиды. Их физико-химические характеристики приве- дены в табл. 2. Для доказательства преимущества новых соединений определены их относительные интенсивности флуоресценции.

Установление относительной интенсив- ности флуоресценции.

Спектры снимают на спектрофлуори- метре Hitachi MPF-4 (Япония) в относительном режиме регистрации при чувствительности 3 в кювете толщиной слоя 1 см. Длина волны возбуждения Аеозб 357 нм, ширина щели возбуждения - 10 нм, эмиссии - 4 нм. Относительную интенсивность флуоресценции рассчитывают по формуле

| -Чз А с 105

где I - высота полосы эмиссии в мм;

с - концентрация в моль/л; А - соотношение максимальной и использованной чувствительности прибора.

Для 6-аминонафталин-1-пентилсульфа- мида (соединение 8 в табл. 3) получают:

820

3,473 -10 5 -3

Измерение флуоресценции 6-амино- нафталин-1-пентилсульфамида.

0,004875 г 6-аминонафталин-1-пентил- сульфамида растворяют в 10 мл 95%-ного этилового спирта, 0,2 мл этого раствора разбавляют 10 мл фосфатного буфера с рН 7,0 (0,067 М) и снимают спектр. Концентрация измеряемого раствора с 3,473-10 моль/л, оптическая плотность при длине

волны возбуждения ОЗБ 0,080. Полоса эмиссии имеет максимум Яфл. 473 нм и высоту -86 нм.

Аналогично измерены спектры флуоресценции остальных предложенных 6-аминезамещенных и известных 5-аминозамещенных нафталинсульфамидов и сопоставлены в табл.3.

Как видно из табл.3, предложенные соединения формулы I обладают более высокой относительной интенсивностью флуоресценции (410-860) по сравнению с аналогом (9-26), что обеспечивает более высокое качество синтезированных на их основе субстратов для флуоресцентного анализа.

Применение соединений формулы 1 в качестве детектируемых групп субстратов, используемых для флуоресцентного анализа пептидаз.

Методика 1. Синтез бромгидрата

а

6-(IM -бензилоксикарбонил) аргинилами- нонафталин-1-метилсульфамида.

а

3,89 г (0,01 моль) бромгидрата (N -бен- зилоксикарбонил)аргинина и 2,36 г (0,01 моль)6-аминонафталин-1-метилсульфамида (1) растворяют в 15 мл сухого пиридина, добавляют 30 мл сухого толуола и отгоняют толуол при пониженном давлении. Реакционную смесь охлаждают до -20°С, добавляют раствор 2,68 г (0,013 моль) дициклогексилкарбодиимида в 6 мл сухого пиридина и выдерживают 30 мин при -20°С, 1 час при +4°С и 20 ч при +20°С. Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, отгоняют пиридин при пониженном давлении, а остаток растворяют в смеси хлоро- форм-пропанол 3:1. Этот раствор промывают 15 мл воды, 15 мл насыщенного водного раствора NaCI, содержащего 1 мл конц. HCI, 15 мл 2%-ного водного раствора аммиака и 15 мл воды. Органический слой отделяют, высушивают над безводным Na2S04, растворитель отгоняют и остаток растирают с сухим толуолом. Продукт отфильтровывают, промывают сухим толуолом, сухим диэтиловым эфиром и перекристаллизовывают из пропанола. Получают 4,93 г (выход 81 %) целевого продукта с т.пл. 126-132°С; / а /о20 -13,3° (с 1; СНзОН), Rf 0,68 (бутанол-уксусная кислота -вода 4:1:2).

Найдено, %: С 49,59; Н 5,32; N 13,63; S 4,63; Вг 12,42.

С25Нз1МбВг505.

Вычислено, %: С 49,42; Н 5,14; N 13,83; 55,28; Вг 13,15.

ПМР спектр ( д, м.д., ДМСО): 2,40 (СНз).

а

Остальные бромгидраты (N -бензи- локсикарбонил)аргиниламинонафталин-1- сульфамидов синтезируют по аналогичной методике. Данные приведены в табл. 4. Методика 2. Взаимодействие бром- си гидрата 6-( N -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин-1-метилсульфамида с тромбином.

К 1,8 мл 1 мкМ раствора бромгидрата

а 6-( N -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин-1-метилсульфамида в 0,02 М трие-HCI буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCI, помещенного в кювету флуориметра и термостатированного при 25°С, добавляют 200 мкл 1 мкМ раствора тромбина в том же буфере и наблюдают рост флуоресценции, фиксируя время, в течение которого в растворе образуется 0,1 мкМ концентрация 6- аминонафталин-1-метилсульфамида. Для этого необходимо 38 мин.

Аналогично проводят определение других пептидаз с использованием бромгидра- тов других аргинильных производных

0

соединений формулы 1. Время гидролиза приведены в табл. 5.

Таким образом, соединения формулы 1 обладают в 40 раз более высокой интенсивностью флуоресценции по сравнению с аналогом и могут быть использованы в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного анализа, так как их арги- нильные производные обладают различной скоростью гидролиза.

Формула изобретения 6-Аминонафталин-1-сульфамиды общей

формулы rfirnr

5

SOZNR1R2

где RI - Н; R2 - СН3, С2Н5, СзН7; i-СзНт, СоНд;

i - С4Н9; t - С4Н9, С5Нц;-О ,Н2С- или Ri - R2 - СНз, C2Hs, WIH-NR,,

-О-О- в качестве детектируемых групп субстратов

для флуоресцентного определения пептидаз.

Т а 6 л и ц а 1

Использование: в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного определения пептидаз. Сущность изобретения: 6-МН2(нафталин)-502НР 2-1, где , R2 линейный или разветвленный (), СбНц, циклогексил, бензил, или Ri- R2 (Ci-C2), или Ri и R2 вместе с атомом азота образуют пиперидин, гексаметилен морфо- лин. Реагент 1: 6-фталимидонафталин-1- сульфамид. Реагент 2: гидразиногидрат в среде метанола при кипячении. 5 табл.

Физико-химические данные 6-фталимидонафталин-1-алкилсульфамидов

. о

сгн

CjH7

1-с,ч,

с,и,

,

,

Продолжение табл. 1

Время (мин) 10%-ного гидролиза соединений формулы I тромбином, фактором Ха,активированным протеином (АПС плазмином, уроки- назой и тканевым активатором плазминогена (ТАП)

|-Qjgj-NHArg(N-Z)-HBr S02NC

Продолжение табл,4

ТаблицаЗ