Способ получения нехолерогенных цАМФ-негативных вариантов холерного вибриона Советский патент 1992 года по МПК C12N15/03 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, к молекулярной биологии, связанной с получением вариантов, дефектных по экспрессии различных признаков.

До настоящего времени неизвестны варианты холерного вибриона, дефектные по уровню внутриклеточного цАМФ. Между тем этот нуклеотид, являясь вторичным мес- сенджером, контролирует синтез более 60 белков прокариотов, влияет на различные функции бактериальных клеток, включая синтез нуклеиновых кислот, различные этапы клеточного деления, проницаемость мембран, репрессию биосинтетических энзимов и регуляторных белков, репликацию плазмид и лизогенизацию бактериофагом. ЦАМФ является непосредственным участником развития патологического процесса при холере, когда при контакте вибриона с эпителием кишечника последним выбрасывается в просвет большое количество циклического нуклеотида. Это, наряду с другими факторами, по-видимому, обусловливает нарушение функций эукариотических клеток.

ЦАМФ-негативный вариант может быть использован для выявления катаболитчув- ствительных генов холерного вибриона, изучения регуляторных процессов в клетке, связанных с особенностями биологии возбудителя, изучения механизма действия нуклеотида при патогенезе, а также для выяснения вопросов взаимосвязи циклонукле- отида и вирулентности.

Известен способ получения цАМФ-не- гативных вариантов бактерий (Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генети- ке.Пер. с англ. М.: Мир, 1976.. с.440). предусматривающий обработку суспензии нитрозогуанидином с последующей инкубацией в бульоне в течение ночи, высев обработанной культуры на среду, содержащую тетразолий, арабинозу, мальтозу, с последующей инкубацией в течение 18 ч: отбор и очистку окрашенных колоний, проверку колоний на способность расти на минимальном агаре с лактозой и минимальном агаре с арабинозой, мальтозой, глицерином, рам- нозой и глюкозой и заключительной проверч«

Ј

VI V|

00

ю

&

кой предполагаемых мутантов на способность расти на минимальном агаре с глюкозой и отвечать на добавление экзогенного цАМФ.

Способ состоит из 7 этапов, требует 5 пересевов на питательные среды с добавлением различных компонентов и затраты времени - 7 дней. К тому же обработка химическим мутагеном сопряжена с неконтро- лируемым повреждением генома в различных его областях, что далеко не всегда соответствует целям эксперимента и порой сильно затрудняет его толкование.

Целью изобретения является ускорение способа получения цАМФ-негативных вариантов холерного вибриона за счет исключе- ния возможности генетических повреждений хромосомального аппарата клетки.

Цель достигается путем конъюгацион- ного введения плазмиды кишечной палочки pGA 6012 (KmR, TcR, SnR, CmR, SuR) в клетку холерного вибриона и высева вибрионов на селективную среду с рифампиционом и одним из следующих антибиотиковжанамици- ном, стрептомицином, тетрациклином. Концентрации антибиотиков подобраны в типовых экспериментах.

П р и м е р 1. Культуру донора Escherichia colt 653 л культуру реципиента Vibrio cholerae cholerae ОГ-75, устойчивого к рифампицину. выращивали 18-20 ч в бульоне сердечной мышцы рН 7,6. На пластинки мясо-пептонного агара рН 7,6 высевали 0,3 мл культуры донора, а затем вторым слоем наносили 0,3 мл культуры реципиента и чашки оставляли при 37°С в течение 3 ч. Клетки смывали 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию после соответствующих разведений высевали по 0,1 мл на мясо-пептонный агар, содержащий 100 мкг/мл рифампицина и 50 мкг/мл кана- мицина. Посевы инкубировали при 37°С в течение 48 ч. Выросшие трансконъюганты, несущие плазмиду pGA 6012, использовали для изучения содержания цАМФ и холеро- генности.

Исходный штамм холерного вибриона ОГ-75, ревертант, полученный после элиминации плазмиды pGA 6012 с помощью бромистого этидия, и трансконъюганты исследовали на содержание цАМФ.

Для этого клетки высевали в 100 мл бульона Мартена рН 7,6 и выращивали при 37°С 5 ч с аэрацией до конца логарифмической - начала стационарной фазы (ОПеоо нм-1,2), осаждали центрифугированием при 6000 об/мин 10 мин, суспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCI рН 7.5 с 4 мМ ЭДТА и лизировали добавлением 100 мкл

хлороформа. Лизат осветляли при 16000 об/мин и исследовали на наличие цАМФ. Количество белка в лизатах определяли методом, основанном на спектрофотометрировании растворов при двух длинах волн, разности в величине оптической плотности при 228,65 и 234,5 нм. Концентрация белка, вносимая в пробу при определении цАМ, составляла 60 мкг.

0 При определении цАМФ инкубацию образцов проводили на ледяной бане в течение 2 ч. Отделение белоксвязанного цАМФ от несвязанного нуклеотида осуществляли адсорбцией свободного нуклеотида

5 на угле марки Норит А, для чего в каждую пробу добавляли 100 мкл угольной суспензии (2,6%-ный раствор угля, 2%-ный раствор БСА) с последующим центрифугированием при 10000 об/мин.

0 Равные количества супернатанта (200 мкл) помещали во флаконы для сцинтилляцион- ного счета и считали на жидкостном сцин- тилляционном счетчике Mark 2. Концентрацию нуклеотида выражали в пи5 комолях 1 мг белка.

Трансконъюганты, несущие плазмиду pGA 6012. при выращивании в богатой питательными веществами среде в конце логарифмической - начале стационарной фазы

0 роста цАМФ, не синтезируют.

Изучение холерогенных свойств проводили на модели кроликов-сосунков, которым под тиопенталовым наркозом вскрывали брюшную полость, извлекали

5 петлю тонкой кишки и в ее просвет вводили взвесь микробов. Затем петлю погружали обратно в кишечную полость, брюшную стенку и кожу зашивали. Для заражения использовали три дозы микробных клеток 103,

0 105 и 107. Погибших и хлороформированных животных вскрывали через 48 ч. Степень холерогенности оценивали по скоплению жидкости в проксимальном отделе толстого кишечника по четырехбальной системе. 065 наружено, что V.cholerae cholerae 0-75 и ревертант, утративший плазмиду pGA 6012, в дозе 10 -107 микробных клеток вызывали большое скопление бесцветной жидкости в проксимальном отделе толстого кишечника.

0 Все изученные трансконъюганты изменений в кишечнике не вызывали. Это свидетельствует о том, что несущие плазмиду кишечной палочки pGA 6012 трансконъюганты полностью утрачивают холерогенные

5 свойства, которые однако могут восстанавливаться после элиминации данной плазмиды.

П р и м е р 2. Культуру донора Escherichia coll G 53 и культуру рифампици- норезистетного реципиента Vibrio cholerae

cholerae ОГ-75 выращивали 18-20 ч в бульоне сердечной мышцы рН 7,6. На чашки мясо-пептонного агара рН 7,6 высевали 0,3 мл культуры донора, а затем вторым слоем наносили 0,3 мл культуры реципиента и чашки оставляли при 37°С в течение 3 ч. Клетки смывали 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию после соответствующих разведений высевали по 0,1 мл на мясо-пептонный агар, содержащий 100 мкг/мл рифампицина и 30 мкг/мл стрептомицина. Посевы инкубировали при 37°С в течение 48 ч. Выросшие трансконъю- ганты, несущие плазмиду pGA 6012, использовали для изучения содержания цАМФ и холерогенности.

Исходный штамм холерного вибриона ОГ-75, ревертант, полученный после элиминации плазмиды pGA 6012 с помощью бромистого этидия, и трансконъюганты исследовали на содержание цАМФ.

Для этого клетки высевали в 100 мл бульона Мартена рН 7.6 и выращивали при 37°С 7 ч аэрацией до конца логарифмической - начала стационарной фазы (ОПеоо нм 1,5). Далее, как в примере 1.

ПримерЗ. Культуру донора Escherlchla coll G53 и культуру рифампици- норезистентного реципиента Vibrio cholerae eltor И-563 выращивали 18 - 20 ч в бульоне сердечной мышцы рН 7,6. На чашки мясо-пептонного агара рН 7,6 высевали 0,3 мл культуры донора, а затем втбрым i слоем наносили 0,3 мл культуры реципиента и чашки оставляли при 37°С в течение 3 ч. Клетки смывали 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию после соответствующих разведений высевали по 0,1 мл на мясо-пептонный агар, содержащий 100 мкг/мл рифампицина и 30 мкг/мл тет- рациклина. Посевы инкубировали при 37°С

в течение 48 ч. Выросшие трансконьюганты, несущие плазмиду pGa 6012. использовали для изучения .содержания цАМФ и холерогенности.

Исходный штамм холерного вибриона И-563, ревертант, полученный после элиминации плазмиды pGA 6012 с помощью акридинового оранжевого и трансконьюганты исследователи на содеражение цАМФ.

Для этого клетки, высевали в 100мл бульона Мартена рН 7,6 и выращивали при 37°С 7 ч с аэрацией до конца логарифмической - начала стационарной фазы ( ОП 600 нм 1.5). Далее как в примере 1.

Все полученные трансконъюганты были цАМФ-негативными и холерогенными.

Таким образом, предложенный способ получения цАМФ-негативных вариантов холерного вибриона, связанных с вирулентностью, требует меньшего числа манипуляций и меньших материальных затрат, исключает повреждение генетической информации клетки холерного вибриона, дает возможность в случае необходимости элиминировать плазмиду и полностью восстановить генотип исходного штамма.

Формула изобретения Способ получения нехолерогенных цАМФ-негативных вариантов холерного вибриона путем обработки исходных клеток холерного вибриона, выращивания и отбора клеток, не содержащих цАМФ и обладающих холерогенностью, отличающийся тем. что. с целью ускорения способа, обработку осуществляют путем совместного выращивания с клетками Escherfchla coll, несущими плазмиду pGA 6012, выращивание проводят в бульоне из сердечной мышцы, а затем на мясо-пептон ном агаре с антибиотиками.

Использование: получение вариантов холерного вибриона, дефектных по экспрессии различных признаков. Сущность изобретения: конъюгационное введение плазмиды кишечной палочки pGA 6012 в клетку холерного вибриона, выращивание и отбор трансконъюгантов, не способных к синтезу цАМФ и не обладающих холероген- ностью.