Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором-33 Советский патент 1993 года по МПК C07F9/09 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и мо- : жет быть использовано для получения нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фос- фором-33. Указанные соединения широко используются в молекулярной биологии, биохимии и т.д. для исследования первичной структуры нуклеиновых кислот, а также для исследования структуры и функций различных ферментов. . ,

. Известен способ очистки нуклеотидов, меченных радиоактивным фосфором, с использованием ВЭЖХ на колонках, заполненных амино.пропилсиликагелем (АПС), в градиенте водного триэтиламмонийбикар- боната (ТЭАБ). Этот способ позволяет получать меченые нуклеотиды высокого качества.

В то же время, указанный способ обладает рядом существенных недостатков, а именно:

при очистке малых (5-10 мКи) количеств меченых нуклеотидов целевой продукт содержит значительное количество ТЭАБ, т.е.

не может быть использовано без предварительного упаривания;

колонки с АПС обладают малым сроком службы и при разовой загрузке 50-100 мКи подлежат замене после 10 хроматографий, что приводит к повышению себестоимости готового продукта и к дополнительному облучению персонала;

для получения продукта с низким содержанием ТЭАБ приходится использовать колонки малого размера, что неудобно при работе в перчаточном боксе;

. для получения меченых нуклеотидов с высокой объемной активностью (20-50 мКи/мл) в водном растворе приходится упаривать готовый продукт для удаления ТЭАБ, что отрицательно схазыЕается на его качестве.,

Цель изобретения - создание метода очистки меченых нуклеотидов, свободного от перечисленных недостатков.

Цель достигается тем, что для очистки нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, используют ион-пар-.

(Л

С

vj

00

о о GO

.N

ную хроматографию на колонках с ОДС в линейном градиенте этанола, а в качестве ион-парного реагента используют ТЭАБ.

С целью оптимизации условий разделения при разработке метода были опробованы хроматографические колонки различного размера. При этом выяснилось, что использование колонок малого размера нецелесообразно, так как в этом случае продукт выходит с колонки в малом обьеме (0,03-0,05 мл) и его трудно собрать. Кроме того, с такими колонками неудобно работать в перчаточном боксе. В то же время использование колонок размером 4x150 мм (объем 1,8 мл) позволяет получить продукт в объеме 0,2-0,5 мл. Экспериментально обнаружено, что использование колонок объемами 1,5-2 мл наиболее рационально для достижения цели.

Дальнейшее увеличение размеров колонки приводите увеличению объема выхо- - да, что нежелательно, поэтому для массовой очистки меченых нуклеотидов были выбраны колонки с размером 4x150 мм. Было экспериментально установлено, что колонка такого размера выдерживает 200-250 хроматографий при разовой загрузке 50- 100 мКи; т.е. в 20-25 раз больше, чем указано в работе 1. Как было установлено экспериментально, ТЭАБ обеспечивает хорошее удерживание нуклеотидов на колонках с ОДС в концентрациях 0,04-0,06 М. Столь низкая концентрация соли позволяет избежать разложения соли на колонке и дает возможность получить готовый продукт с вьгсо кой объемной активностью без обессо- ливания. Снижение концентрации ТЭАБ до 0,025-0,03 М существенно снижает время удерживания нуклеотидов и ухудшает воспроизводимость результатов. Увеличение концентрации ТЭАБ до 0,08-0,15 М не дает существенного выигрыша и приводит к дополнительному солевому загрязнению продукта (табл. 1).

Определение концентрации ТЭАБ в готовом продукте показало, что даже в случае получения последнего в количестве 1-2 мКи она не превышает 0,03 М, такой продукт был пригоден для дальнейшей работы без предварительного упаривания.

Примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Выделение дезоксиаденозин-5 - э 2Р трифосфата..

К реакционной смеси объемом 0,5 мл, содержащей 90 мКи (18 нмоль)« , 10 мКи (2 нмоль) , 3 нмоль АДФ, 50 нмоль АТФ, 0,1 мг белка, 2 мкмоль , 1 мкмоль KCI, 5 мкмоль Trls-HCI, добавляли 0, мл 1 М раствора ТЭАБ, затем

32 г

наносили на колонку Sllasorb Cis размером 4x150 мм, предварительно уравновешенную 0,05 М ТЭАБ. Элюцию проводили градиентом концентрации этанола от 0 до 10%

за 25 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин. Время удерживания дАТФ составляло 19,07 мин, объем фракции, содержащей продукт 0,2 мл, концентрация ТЭАБ в готовом продукте 0,00025 М,

Из фиг. 1 приведен профиль элюции а- , цифрами отмечены: 1 - АДФ; 2 - АТФ; 3 - а- Р дАМФ; 4 - а .

Аналогичное выделение 100 мКи а- позволило получить готовый продукт с объемной активностью 10-50мКи/мл в водном растворе с концентрацией ТЭАБ 0,002-0,02 М без дополнительного обессо- ливания. . .

Пример 2. Выделение гуанозин-5 а-32Р монофосфата.

К реакционной смеси объемом 0,20 мл, содержащей 80 мКи (16 нмоль)а , 20 мКи (4 нмоль) у , 100 нмоль/3

-NAD, 40 нмоль АДФ, 5 мкмоль Tris-HCl, 1 мкмоль KCI, 2 мкмоль MgCia и 0,1 мг белка, добавляли 0,01 мл 1 М раствора ТЭАБ, затем наносили на колонку Silasorb CIB размером 4x150 мм, предварительно уравновешенную 0,05 М водным ТЭАБ. Монофосфат элю- ировали градиентом концентрации этанола от 0 до 10% за 25 мин, скорость потока 0,5 мл/мин. Время удерживания а составляло 12,19 мин, объем фракции содержащей ГМФ 0,3 мл. /На фиг. 2 приведен профиль элюции а

, цифрой 1 отмечен . Выделенный таким образом продукт далее подвергался ферментативному фосфо- рилированию до соответствующего

трифосфата с выходом 95-100% без какой- либо дополнительной обработки.

Пример 3. Выделение аденозин-5,- у-32Р трифосфата.

К реакционной смеси объемом 0,15 мл,

содержащей 85 мКи (16 нмоль) у-32Р АТФ, 40 нмоль АДФ, 100 нмоль/3-NAD, 5 мкмоль Tris-HC, 1 мкмоль КС, 2 мкмоль MgCl2 и 0,2 мг белка, добавляли 0,01 мл 1 М раствора ТЭАБ, затем наносили на колонку Silasorb

Счв размером 4x150 мл, предварительно уравновешенную 0,05 М водным ТЭАБ. Три- фосфатэлюировали градиентом концентрации этанола от 0 до 10% за 25 мин, скорость потока 0,5 мл/мин.

Время удерживания у-АТФ составляло 17,74 мин, объем фракции, содержащей .у- АТФ 0,2 мл, концентрация ТЭАБ в готовом продукте 0,00035 М.

На фиг. 3 приведен профиль элюции у

, цифрами отмечены: 1 - АДФ; 2 - у-32Р АТФ.

Пример 4. Выделение уридин-5,

-32Р трифосфата.

К реакционной смеси объемом 0,5 мл, содержащей 70 мКи (14 нмоль) а-32Р УТФ, 10 мКи а-32Р УМФ, 50 нмоль АТФ, 0,1 мг белка, 2 мкмоль MgCte, 5 мкмольТг з-НС1, добавляли 0,025 мл 1 М раствора ТЭАБ, затем наносили на колонку Silasorb da размером 4x150 мм, предварительно уравновешенную 0,05 М ТЭАБ.

Элюцию проводили градиентом концентрации этанола от 0 до 10% за 25 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин. Время удерживания а-32Р УТФ составляло 14,57 мин, объем фракции, содержащей продукт, 0,3 мл, концентрация ТЭАБ в готовом продукте 0,0004 М.

На фиг. 4 приведен профиль злюции а

, цифрами отмечены: 1 - а- 32Р УМФ;2- а 32Р УТФ;3-АТФ,

Время удерживания для других нуклео- зид-5 -моно- и трифосфатов, меченных фос- фором-32 и фосфором-33, приведено в табл. 2.

J Q

( Р)-нуклеотиды не отличались от сооветствующих (32Р)-нуклеотидов по своим

хроматографическим параметрам (время

удерживания, ширина пика, объем элюции

.и т.д.).

Химическая чистота и концентрация .ТЭАБ в готовых препаратах приведены в табл. 3. Радиохимическая чистота всех выделенных продуктов составляла 97-99% даже при выделении смеси, содержащей 150 и более мКи меченого соединения.

Таким образом, совокупность известных признаков с предложенными существенными отличиями, а именно использование ион-парной высокоэффективной хроматографии на колонках определенных размеров с определенным наполнителем, а также экспериментально

подобранных условий и режимов проведения элюирования обеспечили достижение цели - высокую химическую чистоту; снижение облучения персонала за счет более удобных условий работы в боксе и значительного увеличения срока службы колонок.

Формула изобретения Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, путем пропускания реакционной смеси через высокоэф- фективную колонку с производным силикагеля г последующим элюированием нуклеотидов,с использованием триэтилам- моний карбоната, отличающийся тем,

что, с целью повышения химической чистоты целевого продукта, увеличения срока службы колонок и повышения безопасности процесса., используют ион-парную высокоэффективную жидкостную хроматографию

на колонках, заполненных октадецилсили- кагелем, объемом 1,5-2 мл, а элюирование проводят линейным градиентом вода - эта- нол от 0 до 10% за 25 мин, причем в качестве ион-парного реагента используют триэтиламмонийбикарбонат в конечной концентрации 0,04-0,06 М.

Таблица

Использование: молекулярная биология, биотехнология, очистка нуклеотидов. Сущность: использование ион-парной хро- матографии на колонках, заполненных окта- децилсиликагелем объемом 1,5-2 мл( элюирование линейным градиентом вода - этанол от 0 до 10% за 25 мин, в качестве ион-парного реагента используют триэтм- ламмонийбикарбонат в конечной концентрации 0,04-0,06 М. 4 ил., 3 табл.

Зависимость времени удерживания,химической чистоты нуклеотида и концентрации ТЭАБ в готовом продукте от концентрации ТЭАБ в элюирующем растворе для дезоксиаденозин5 - а-32Р трифосфата (см. пример 1)

Примечание. Химическую чистоту выделенного продукта определяли хроматогра- фически по методике, приведенной в работе 1, с. 464. Концентрацию ТЭАБ определяли кондуктометрическим методом по калибровочным кривым,

Время удерживания различных нуклеотидов.

Примечание.

Разброс во времени удерживания в различных опытах составлял не более 5%. ч

Продолжение таблицы 1

Таблица 2

Таблица 3

Сравнение качества препаратов, выделенных методами ионообменной и ион-парной хро матографии

Примечание. Ион-парную хроматографию проводили, как в примерах 1-4 . Активность нуклеотида составляла 50мКи, Химическую чистоту выделенного продукта определяли хроматографически по методике, приведенной в работе 1, с.464.Концентрацию ТЭАБ определяли кон- дуктометрическим методом по калибровочным кривым.

Фаг. 1

0.00

Редактор Е.Хорина

Фиг. 4

Составитель Л.Панфилова Техред М.Моргентал

Фиг.З

Корректор С.Шекмар