Способ получения аденозин-5-монофосфата,меченного фосфором-32 Советский патент 1984 года по МПК C07H19/20 C07H19/02 

Изобретение относится к получению аденозин-5 -монофосфатов, конкретно к усовершенствованному способу получения аденозин-З-монофосфата меченного фосфором-32 (З- р-ДМФ) общей формулы нсГ-р-осНг N . ОН ОН Применение нуклеотидов, меченных фосфором-32(), является весьма значительным во многих исследования В частностиi аденозин-5-монофосфорная киЬлота (5-АМФ) с меткой Р используется для изучения строения и метаболизма нуклеиновых кислот и их компонентов С0 также является исходным продуктом для син теза Р -аденозинтрифосфата(2 J Известные способы получения мече ной 32 Р аденозин-5-мрнофосфорной кислоты () подразделяются на Ферментативные и химические З. и 41 Однако получение АМФ химически1 и способами продолжительно во времени, требует сложного аппаратур ного оформпения и не позволяет полу чать высоких.молярных активностей. Энзиматические методы получения 5- Р АМФ дают хррошие результаты, н для проведения этого синтеза необходимо первоначально синтезировать АТФ и перед использова-нием под вергнуть его очистке. Кроме того, сам процесс получения целевого продукта связан со сложными манипуляциями с радиоактивными веществами, продолжителен во времени и требует наличия аденозинкиназы. Недостатком его является также необходимость ис пользования больщого числа (более 10) труднодоступных ферментов и необходимость контролировать полноту превращения радиоактивного субстрата после каждой-из стадий введения соответствующего фермента, что требует сложной и дррогостоящей аппара туры. Для энзиматических, как и для химических способов синтеза . АМФ также требуется предварительно получать меченные Р соединения. Наиболее близким к изобретению.по технической сущности является способ, заключающийся в облучении быстрыми нейтронами на Ро-Ве источнике системы четыреххлористьй углерод 2,3-0-анизилиденаденозин-пиридин, при этом атомы фосфора-32, образовавшиеся по ядерной реакции СР ( и,о ) Р стабилизируются в форме аденозин-З -монофоефата. Ядерная рб акция С ( n,ot ) 32р протекает при облучении быстрыми нейтронами любых хлорсодержащих соединений и имеет следующие преимущества: протекает с изменением порядкового номера элемента, вследствие чего радиоактивный Р образуется в состоянии без носителя, т.е. без разбавления нерадиоактивными изотопом Р, что позволяет получать меченные препараты с удельной активностью, близкой к предельно возможной; наличие атомов хЛора в системе способствует протеканию химических реакций, необходимых для Получения целевого продукта. Атомы 2р в момент образования имеют кинетическую энергию порядка 30 кэВ за счет отдачи при испускании об - частицы, вследствие чего они обладают повышенной реакционной способностью и в процессе столкновений с молекулами ССС4 в основном отрывают атомы хлора, образуя хлориды. р ссе. CCf4 32 32 „ -I с Г1ри наличии в системе растворенного кислорода возможно образование хлорокиси фосфора PCPjtl/zOj - 32 РОС8з Образзпощиеся хлориды фосфора фосфорилируют 2 ,3 -0- анизилиденаденозин. После облучения системы (мишени) нейтронами защитнью группы удаляют гидролизом и вьщеляют целевой продукт с помощью бумажной хроматографии. Преимуществами известного способа являются совмещение в одну стадию ядерной реакции получения радиоактивного изотопа и необходимых превращений, ведущих к образованию целевого продукта, получение р в состоянии без носителя, что позволяет достичь предельно возможной активности меченных препаратов, существенное упрощение аппаратурного оформления и сокращение син теза целевого продукта |,5 J. Однако радиохимический выход 5- Р-АМФ по известному способу недостаточно высок (22-23%) и трудно воспроизводим уз-за сильной завиС1ШОСТИ результатов от степени осушки всех используемых в системе компонентов.. Целью изобретения является повышение выхода аденозин-5 -монофосфата меченного фосфором-32. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения аденозин-5 -монофосфата меченного фосфором-32 путем облучения нейтронами на прлоний-бериллиевом источнике нейтронов смеси, содержащей 2,3-0-анизилиденаденозин, четырех хлористый углерод в качестве хлорсодёржащего соединения - источника фосфора-32 и органический растворитель с последующим удалением защитных групп гидролизом, в качестве ор ганического растворителя используют N,N-диметилформамид или диметилсульфоксйд в концентрации 0,20,5 мол.% и процесс проводят в присутствии конденсирующего агента трихлбрацетонитрила в концентрации 0,5-1,0 мод.%. Облучение проводят в течение 24.150 ч. Защитные группы удаляют гидролизом. Выход целевого продукта увеличивается до по сравнению с 22-237, в известном способе. Для выяснения-,влияния добавок на распределение Р в неорганической и органическбй формах облучают системы состава С €84 органический раство- ритель и СС ССРз CN - органический растворитель. Полученные результаты приведены в табл.2 (мишень t). Для анализа облученных мишеней и вьзделения 5- Р-АМФ используют бумажную хроматографию. Разделение rtpo водят восходящим способом при комнат ной температуре на бумаге FN-12, ирпользуя следующие системы растворителей: ацетонитрил - мзфавьиная кислота-вода-аммиак(конц)в соотношении 18:3:6:0,2 (1); 1М CH COOHNH (рН 7,5) т этанол в Соотношении 3:7 (2); изопропиловьй спирт-водааммиак (конц) в соотношении 7:2:1(3) изомасляная кислота-вода-аммиак (конц) в соотношении 66:33:1 (4). 884 Величины Рр свидетелей в указанных системах растворителей приведены в табл.1. . . Таблица 1 Пятна свидетелей обнаруживают обработкой молибдатным раективом б J, а .нуклеотиды кроме того по поглощению в УФ-свете. Радиоактивные сое1динения фосфора обнар5гживают с пр мощью радиоавтографии на рентгеновской пленке РМ-1 и на установке автоматического радиометрирования радиоактивных хроматограмм с использованием счетчика -излучения СБТ-13 с коллиматором шириной 3 мм. Сигнал со счетчика подают на интенсиметрПИ-4 и записывают на потенциометре ЭШ1-09. Скорость протягивания хроматограмм составляет 180 мм/ч. Использовавшийся для облучения марки ОСЧ дополнительно пропускают через Ькись высшей степени активности и перегоняют, предохраняя от влаги воздуха. Органические растворители (N,N-диметилформамид и диметилсульфоксвд), а также трихлорацетонитрил перегоняют над гидратом кальция и хранят над молекулярнъм ситом 4 А . Облучение проводят при комнатной температуре (15-25 с) в стеклянных колбах на 250 мл, в центре которых с помощью пробирки на пшифе помещают Ро-Ве источник нейтронов интенсивностью около 10Т нейтр/с или на генераторе нейтронов НГИ-5 мощностью около 10 нейтр/с. Время облучения 1-6 сут. После облучения к мишени добавляют 10 мл дистнлли,рованнрй воды, тщательно перемешивают и отгоняют основную массу мишени в вакууме водоструйного насоса.

Защитные группы аденозина уда|ДЯют нагреванием с 80%-ной уксусной ислотой при 100°С, кислоту удаляют упариванием в вакууме и остаток хроматографируют в одной из систем растворителей. Зону, соответствующую. 5- Р-АМФ, элюирзпот водой и чистоту целевог о. продукта проверяют хроматографированием в другой системе растворителей. Данные анализа облученных мишеней приведены в табл табл.2.

Таблица 2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕН031Щг -5 -МОНОФОСФАТА, МЕЧЕННОГО ФОСФОРОМ 32, путем облучения нейтронами на полоний-бериллиевом источнике нейтронов смеси, содержащей 2 ,3-0-анизилиденаденозин, четыреххлористый углерод в качестве хлорсодержащего соединения - источника фосфора-Э2 и органический растворитель, с последуюпщм удалением защитных групп гидролизом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве органического растворителя используют Ы,К-диметилформамид или димет тилсульфоксид в концентрации 0,20,5 мол.% и процесс проводят в присутствии конденсирующего агента трихлорацетонитрвла в концентрации 0,,0 мол.%. к -ч| 00 00 00

Облучение проводили на нейтронном генераторе. Фрсфорилирование в мишенях с добавкой пиридина дает неустойч1:вые и низкие результаты. С целью повышения вькода 32р 5-ДМФ в систему вводят различные добавки: триэтиламин, ДМФА, ДМЗС, трихлорацетонитрил в количествах не более 1 мол.%, чтобы свести до минимума их влияние на распределение фосфора-32 между органической и неорганической формами. ДМФА и триэтиламна желаемо. п эффекта не дают, кроме того, при добавлении Приэтиламина в систему

происходит значительное осмоление, что затрудняет выделение конечных продуктов. Значительное повышение выхода целевого продукта дает добавка 1 мол.% трихлорацетонитрила.

2,3-0-защищенные производные аденозина очень плохо растворимы в четыреххлористом углероде. В объеме МИШЕНИ (250 мл ) не растворяется полностью даже 4 мг 2,3-0-анизилиденаденозина. Поэтому навеску производного аденозина предварительнорастворяют в ДМФА или ДМ50 (около 1 мл) и в виде раствора вносят в мишень. Анализ мишени состава ССР4 12 ,3-0-анизилиденаденозин СС CNДМФА показал, что 40-44% образующего ся по ядерной реакции (п,о6 ) Р фосфрра-32 выделяется в виде 5-ТАМФ. Для выяснения влияния добавок на распределение фосфора-32 между органической и неорганической формами стабилизации по сравнению с чистым ССР4 проведено облучение и анализ систем состава: CCf4-ССЕ, C/V; ССб ДМФА; €«4-ДМ50- ССЕ4-CCe, CN-ДМФА, ССе4-ССеэ СН-ДМ50, при различных концентрациях добавок. Установлено, что введение указанных веществ в количествах до 1 мол.% практически не влияет на распределение фосфора32 в системе. Препарат 5- Р-АМФ испытан на устойчивость к ферменту,, избирательно гидролизующему моноэфиры фосфорной кислоты (ФЮ, КФ 3. .1.3.1). Анализ полученных продуктов проводят ме тодом тонкослойной хроматографии на ПЭИ-целлюлозе с последующей радио автографией полученных продуктов. Результаты испытаний -подтвердили структуру препаратов как 5 - Р-АМФ Пример . Смесь 400 г (2,6,моль) ССРд, , 0,004 г () 2,3-О-анизилиденаденозина, 2,88 г (0-,02 моль) трихлорацетонитрила и 0,95 г (0,013 моль) К,К-диметилформамида облучают на Ро-Ве источнике нейтронов мощностью 5-10 нейтр/сек в течение 6 сут. После облучения основную массу мишени отгоняют под вакуумом водоструйного насоса при температуре не вьше 40°С. Затем в колбу добавляют 2 мл 80%-ной СНзСООН и нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После этого удаляют кислоту под вакуумом водоструйного насоса при температуре не вьше . Для выделения из остатка 5-Т-А№ его наносят на бумажную хроматограмму (бумага FN-13) размером мм. На такую же хроматограмму наносят смесь соединений - свидетелей и обе хроматограммы одновременно злюируют в водной камере в системе растворителей ацетонитрил-муравьиная кислотавода-аммиак (конц.) в соотношении 18:3:6:0,2. После разделения положение свидетеля 5-АМФ определяют по поглощению в УФ-свете, а остальных соединений - с помощью молибдатного реактива. Путем сравнения определяют положения 5 - Р-АМФ на радиоактивной хроматограмме, соответствующую зону злюируют дистиллированной водой. Получают меченный фосфором-32 аденозин-5-монофосфат в состоянии без носителя с общей активностью около 10 МБк. Таким образом, по предлагаемому способу можно получать целевой продукт активностью вплоть до tO МБк путем облучения мишеней указанного состава на мощном источнике нейтронов или нейтронном генераторе. Эффективность предлагаемого способа по сравнению с известным заключается в увеличении радиохимического выхода целевого продукта до 36-44% вместо 22-23% по известному способу и существенном улучшении воспроизводимости получаемых результатов .