Способ получения вакцины против колибактериоза цыплят Советский патент 1993 года по МПК A61K39/108 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к разработке технологии получения коливэкцины, которая может быть использована в ветеринарии для иммунопрофилактики колибактериоза цыплят.

Известен способ получения коливакцины при выращивании Escherlchla coli на питательной среде следующего состава, мае. %: агар-агар 1,0-2,0, пептон 0,1-0,5, глюкоза 0,1-0,5, асперагиновая кислота 0-0,4, де- зоксихолат натрия 0-0,2, дрожжевой экстракт 0-0,1, минеральные соли (MgS04, MnCl2, FeCI, CaCl2) 0,001-0,00001.

Колибактерии выращивают поверхностным способом при температуре 37°С, после бактерии смывают буферным раствором с поверхности агара до концентрации клеток от 109 до 1010/мл. Следующим этапом получения вакцины является инактивация бактериальных клеток при помощи химических и физических средств. Как химическое средство применяется формальдегид, а в качестве физического фактора применяется облучение гамма лучами с добавкой окиси

алюминия или сапонина. После инактивации клеток проводится сепарирование.

Недостатком этого способа является применение метода поверхностного культивирования колибактерий, небольшой выход количества клеток и получение вакцины в жидком виде.°

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является получение вакцины против колибактериоза птиц при выращивании раздельно штаммов Е, coli № 211 и №216 глубинным способом в условиях аэрирования до получения бактериальной массы 20-30 млрд. микробных тел/мл в бульоне Хоттингера с добавкой глюкозы, инактивирование формалином в количестве 0,2-0,4% в течение 3-4 суток при температуре 37-38°С.

Бульонные культуры центрифугируют в течение 35-40 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок разбавляют забуференным физологическим раствором рН 7,2-7,9. Полученную взвесь культур штаммов соединяют в равных объемах (1:1) и консервируют

Х|

Ч

ю

W

о

со

раствором тиомерсана в количестве 0,005- 0,01%.

Содержание компонентов в полученной вакцине следующее.

Компоненты вакцины Содержание в 1 л Антигены эшерихия Минимум, максимум

(клеток): Е. coll №211

Е. coll № 216 Формалин (см Тиомерсан (см3) Забуференный физиологический раствор

4.10135.1013

2.10132,5.1013

2.10132,5.1013

2

0,05

до 1 л

4 0,1

Недостатком этого способа является применение дорогой питательной среды - бульона Хотгингера, получение небольшого выхода количества клеток, получение вакцины в жидком виде, сложность и длительность технологического процесса.

Цель изобретения - повышение выхода вакцины, упрощение и ускорение способа.

Это достигается путем выращивания Ecsherichia coli глубинным способом при регулировании аэрации и рН среды на питательной среде следующего состава, мае. %: Крахмал осахаренный1,5 Пептон -1,5 Кукурузный экстракт 0,75 Вода водопроводная Остальное Далее проводится концентрирование культуральной жидкости, инактивация и осаждение клеток колибактерий двумя объемами охлажденного до -10°С ацетона, центрифугирование осадка и высушивание в вакуумной сушилке при 35-40°С.

Существенным отличием заявляемого способа получения коливакцины является регулирование аэрации и рН среды, что обеспечивает ускорение роста бактерий.

На протяжении 8 часов воздух подают из расчета 10 м3 в час на 1 м3 культуральной жидкости, затем подачу воздуха увеличивают до 15 м3/час,

Суть регулирования рН среды в пределах 7,0-7,2 заключается в том, что при выращивании колибактерий без регулирования рН питательная среда подкисляется до 4,5- 4,0, что является причиной замедления роста. Число клеток составляет 5-10 млрд./мл. Подача аммиака в ферментер после 5 часов роста и поддержание рН на одном уровне резко увеличивает число клеток до 30-40 млрд,/мл.

На 12-том часу роста рН в ферментере самопроизвольно подщелачивается до 7,6- 7,8, после чего выращивание прекращают.

0

5

0

5

0 5

0

5

0 5

Другим отличием является уровень технологического процесса, включающий применение двух объемов ацетона в качестве инактиватора и осадителя клеток колибактерий, что обеспечивает получение (после центрифугирования и сушки) сухого препарата коливакцины и упрощает применение ее в широких масштабах в ветеринарии.

Пример. Для глубинного культивирования колибактерий использовали питательную среду следующего состава, мае. %: Крахмал осахаренный1,5 Пептон 1,5 Кукурузный экстракт 0,75 Водопроводная вода 96,25 1. Приготовление питательной среды.

а) осахаривание крахмала

75 кг нерастворимого крахмала кукурузного заливают 1 м водопроводной воды, подогревают до 40°С, добавляют 375 г ами- лосубтилина ГЗх, рН доводят до 6,6, подогревают до 85°С и выдерживают при перемешивании в течение 30 минут. Далее кипятят в течение часа, охлаждают до 75°С, добавляют 175 г амилосубтилина ГЗх, проверяют качество осахаривания с йодом (не должен дать синего окрашивания), рН доводят до 5,0 при помощи ортофосфорной кислоты, охлаждают до 58°С, прибавляют 12,5 л глюкаваморина Гх с активностью 50 ед/мл и выдерживают при температуре 58°С в течение 6 часов. Таким образом приготовленный осахаренный крахмал стерилизуют при температуре 120°С в течение 30 минут.

б) приготовление раствора пептона 75 кг пептона растворяют при перемешивании в 1 м водопроводной воды.

в) приготовление полной питательной среды

К 1 м водопроводной воды при перемешивании прибэвляют37,5 кг кукурузного экстракта и 1 м пептонного раствора. Общий объем воды доводят до 4 м3 (с учетом 20% конденсата). Растворы кукурузного экстракта и пептона стерилизуют при температуре 130°С в течение 30 минут.

После стерилизации компоненты питательной среды, то есть кукурузный экстракт, пептон и осахаренный крахмал объединяют, охлаждают до 38°С, доводят рН до 7,6 и засевают односуточной культурой Escherichia coli в количестве 0,1% по обье- му.

2. Получение биомассы колибактерий.

Выраа(ивание Е. cofi проводят в ферментере емкостью 10 м3с рабочим объемом питательной среды 5 м глубинным способом при температуре 38°С в течение 12 часов при постоянном перемешивании и аэрации, причем в первые 8 часов воздух

подают из расчета 10 м3 в час йа 1 м3 куль- туральной жидкости, затем подачу воздуха увеличивают до 15 м3/час. После 5 часов роста рН резко падает до 7,0. Для поддержки рН в пределах 7,0-7,2, автоматически включают подачу аммиака. На 12-том часу роста рН в ферментере самопроизвольно подщелачивается до 7,6, после чего выращивание прекращают.

С 5-часового возраста каждый час определяют популяцию и количество клеток в одном мл культуральной жидкости при помощи отраслевого стандартного образца мутности (ОСО 42-28-85-86).

3. Получение целевого продукта.

После прекращения выращивания куль- туральную жидкость концентрируют, охлаждают до 4°С и осаждают 2-мя объемами охлажденного до -10°С ацетона. Ацетон добавляют небольшими порциями при непрерывном перемешивании. Полученный осадок центрифугируют, высушивают в вакуумной сушилке при и измельчают,

В полученной по такому способу сухой вакцине определяют количество клеток, которое составляет 3-Ю12 в грамме (средние данные 5-ти опытов).

Па физико-химическим показателям ко- ливакцина должна соответствовать требованиям, представленным в табл. 1.

Целесообразность применения двух объемов ацетона для получения коливакци- ны показана в табл. 2,

Как видно из данных, представленных в табл. 2, оптимальный выход целевого продукта получен при осаждении двумя объемами ацетона.

0

5

0

5

0

5

0

Применение предлагаемого технологического процесса обеспечивает возможность в 100 раз увеличить выход .количества клеток колибактерий и сократить технологический процесс.

Получение коливакцины в виде сухого, препарата упрощает применение ее в широких масштабах в ветеринарии для иммунопрофилактики колибактериоза цыплят.

Формула изобретения

Способ получения вакцины против ко- либактериозэ цыплят, включающий глубинное выращивание культуры Escherichia coli в питательной среде в условиях аэрации, инактивацию полученной культуры, ее концентрированнее последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода вакцины, упрощения и ускорения способа, используют питательную среду следующего состава, мае. %:

Крахмал осахаренный1,5 Пептон 1,5 Кукурузный экстракт 0,75 Вода Остальное, при выращивании культуры в первые восемь часов воздух подают из расчета 10 м3/ч на 1 м3 культуральной жидкости, а затем подачу воздуха увеличивают до 15 м /ч, при этом в процессе выращивания рН среды поддерживают в пределах 7,0-7,2, инактивацию и концентрирование культуры проводят одновременно двумя объемами ацетона, осадок отделяют центрифугированием и полученный целевой продукт высу- шивают и измельчают,

Т а б л и ц а 1

Использование: микробиологическая промышленность, ветеринария, иммунопрофилактика колибактериоза цыплят. Сущность изобретения: выращивание Е. coli ведут глубинным способом при постоянной аэрации, перемешивании и автоматическим регулированием рН после 5 ч роста в пределах 7,0-7,2. Инактивацию и осаждение клеток проводят двумя объемами ацетона с последующим центрифугированием, высушиванием и измельчением осадка. 2 табл.

Физико-химические показатели коливакцины

Показатели

Характеристика

Внешний вид

Цвет Массовая доля влаги,

% не более

Крупность помола:

проход через сито

№ 38, % не менее

остаток на сите

№ 27 , % не более

оличество клеток в грамме

препарата

Мелкий порошок Светло-коричневый

10

65

20

3-10

Метод испытания

По ГОСТ 20264.1-74 По ГОСТ 20264.1-74

По ГОСТ 20264 1-74

По ГОСТ 4403-77

По ГОСТ 4403-77

ОСО-42-59-86

Количество клеток при осаждении бактерий различным объемом

ацетона

Таблица2