Способ культивирования гибридных клеток мыши Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 C12N5/02 

: Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования гибридных клеток мыши (гибридом), необходимых для производства моноклональных антител.

Известен способ культивирования гибридных клеток мыши путем суспёндирова- ния клеток в питательной среде ДМЁМ, содержащей 10% сыворотки крови плодов коров, с последующим инкубированием при 37°С.. :; ,. ..: ;: V;Однако известный способ не обеспечивает вырокого выхода клеток и продуцируемых ими моноклональных антител.

Цель изобретения - увеличение выхода гибридных клеток.и продуцируемых ими моноклональных антител.

Поставленная цель достигается тем, что способ выращивания гибридных клеток осуществляют путем суспенди рова ния клеток в питательной среде, содержащей сыворотку крови плодов коров, с последующим инкубированием при 37°С. При этом суспенди- рование клеток осуществляют в

присутствии коллагеновых микроносителей, концентрация которых в питательной среде составляет 2-3 мг/мл. . Отличительным признаком описываемого способа является проведение суспен- дирования клеток в присутствии коллагеновых микроносителей, взятых в концентрации 2-3 мг/мл.

Коллагеновые микроносители представляют собой порошкообразную массу с частицами размером по длине 180+60 мкм диаметром 80-100 мкм.

П р и м е р 1. Во флакон со средой ДМ ЕМ стерильно после добавления сыворотки крови плодов коров из расчета 10% и гента- мицина в конечной концентрации 0,8 мг/мл пипеткой вносят в субсидированный в этой .же среде коллагеновый микроноситель, доведя его до концентрация 3 мг/мл. Затем во флакон переносят гибридные мышиные клетки линии ИКО-8 1 так, чтобы их конечная концентрация в суспензии составила 5x105

Х|

Ю 4 О

ел о

кл/мл. Флакон помещают в термостат и выдерживают при 37°С.

. Через 46 ч концентрация гибридных клеток составляет 5,6x10 кл/мл, а титр мо- ноклональных антител в культуральной жидкости -1:50, в то время как по протоколу в контроле без добавления микроносителя концентрация гибридных клеток равна 2x10 кл/мл, а титр моноклональных антител в культуральной жидкости 1:10. Титр ан- -тител определяют в реакции непрямой .иммунофлюоресценции с использованием в качестве антигенного материала мононук- леарных клеток периферической крови здоровых лиц.

Пример2,Во флакон со средой ДМЕМ стерильно после добавления1 сыворотки крови плодов коров из расчета 10% и гента- мицина в конечной концентрации 0,8 мг/мл пипеткой вносят суспендированный в этой же среде коллагеновый микроноситель, доведя его концентрацию до 2 мг/мл. Затем флакон засевают гибридными мышиными клетками ИКО-10 2 так, чтобы их конечная концентрация в суспензии составила 4х105 кл/мл. Флакон помещают в термостат и выдерживают при 37°С.

Через 48 ч количество гибридных клеток составляет 4,8хЮ6 кл/мл, а титр моноклональных антител в культуральной жидкости 1:50, в то время как в контроле по протоколу без добавления микроносителя концентрация гибридных клеток равна 2,3х10б кл/мл,

а титр антител равен 1:1. Титр антител определяют в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве антиген-положительных клеток фиксированных ацетоном тимоцитов эмбрионов человека.

Обоснование выбора оптимального интервала концентраций коллагенового микроносителя представлено в таблице.

Предлагаемый способ разработан в лаборатории моноклональных антител Горь- ковского НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава РСФСР ив лаборатории полимерных носителей Научнопроизводственного Центра медицинской биотехнологии Минздрава СССР и проверен в лаборатории иммунодиагностики и диспансерного наблюдения вирусных гепатитов Горьковского НИИЭМ. Акт проверки

прилагается. Планируется использование метода при крупномасштабном производстве диагностических и терапевтических препаратов моноклональных антител с использованием управляемого аппаратного

культивирования. Предлагаемый способ позволяет повысить выход гибридных клеток и продукцию ими моноклональных антител по сравнению с известным. Кроме того, способ может быть использован для аппаратного

культивирования гибридом с целью наработки массовых количеств диагностических или терапевтических моноклональных антител.

Использование: иммунология, биотехнология. Сущность изобретения: гибридные клетки мыши ИКО-8, ИКО-10 засевают в питательную среду, содержащую сыворотку крови плодов коров. Вносят предварительно суспендированный в той же среде колла- геновый микроноситель в концентрации 2-3 мг/мл. Клетки инкубируют при 37 С. Выход клеток увеличивается в 2-2,5 раза. 1 табл.

Формула изобретения

Способ культивирования гибридных

клеток мыши, включающий посев клеток в

питательную среду, содержащую сыворотку

крови плодов коров, инкубацию при 37°С,

отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода гибридных клеток и моноклональных антител, культивирование осуществляют в присутствии коллагенового микроносителя в концентрации 2-3 мг/мл.

на

Концентрацию клеток определяли после разрушения микроносителя раствором трипси- Титр антител определяли в реакции непрямой иммунофлуоресценции