Способ определения генетической идентичности индивидуумов Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 C12N15/00 

Изобретение относится к биологии и медицине, точнее, к исследованию биологических материалов человека и животных им- мунологическими методами.

Цель изобретения - ускорение и упрощение способа.

Пример 1. Используют человеческие лимфоциты иаутогранулоциты, выделенные из периферической крови донора А в двухступенчатом градиенте фиколл - верографи- на (d 2,007 и 1,119 г/см3). Фракцию лимфоцитов ( 1,077 г/см3) и фракцию гранулоцитов (d 1,119 г/см3) трижды отмывают в среде 199. Фракцию лимфоцитов, для удаления моноцитов, инкубируют в течение 1 ч при 37°С в емкости из пластика (например, в бакпечатках однократного применения) в среде 199.

Монослой гранулоцитов готовят инкубированием этих клеток в среде 199 (исходмая концентрация гранулоцитов - 9 х 106 мл)

. на покровном стекле в бакпечатке в течение

1 ч при 37°С. Затем бакпечатку освобождают от среды 199 с неприлипшими гранулоцитами и помещают в бакпечатку 0,5 мл лимфоцитов (в концентрации-2 х 10 /мл среды 199). После инкубации лимфоцитов с гранулоцитами в течение 1 ч при 37°С препарат фиксируют добавлением в инкубационную среду 1 капли 3 %-ного раствора глутарово- го альдегида.

Через 10 мин покровное стекло извлекают из бакпечатки, высушивают, проводят дополнительную фиксацию в этиловом спирте 15 мин и окрашивают по Романов- скому-Гимза - 45-60 мин. Препарат промы- вают 5-7 раз дистиллированной водой, помещают на предметное стекло и высушивают.

При помощи светового микроскопа под иммерсией регистрируют сто лимфоцитов и определяют процент этих клеток, присоеди- . нившихся к своей поверхности 3 и более грануяоцита.

ел

С

00

о о со о

Os

Подучен следующий результат- в крови у донора А 10 % лимфоцитов образуют розетки с аутогранулоцитами, что свидетельствует о генетической идентичности.

При м е р 2. Используют человеческие лимфоциты донора А и человеческие алло- генные гранулоциты донора Б. Последовательность выделения клеток из крови и методика их взаимодействия аналогичны примеру 1.

Получен следующий результат - лимфоциты донора А не образуют розеток с грану- лоцитами донора Б (аллогранулоцитами), т. е. лимфоциты генетически неидентичны гра- нулоцитам.

П р им е р 3. Используют человеческие лимфоциты донора А и крысиные грануло- циты (ксеногранулоциты). Последовательность выделения клеток из крови и методика их взаимодействия аналогичны примеру 1.

Получен результат - человеческие лимфоциты (донора А) не образуют розеток с крысиными гранулоцитами (ксеногрануло- цитами), т. е. лимфоциты генетически неидентичны гранулоцитам, взятым для исследования.

Обследование 8 доноров показало, что процент лимфоцитов, образующих розетки с аутогранулоцитами колеблется от 6 до 10- 8,1 ±0,5 %. Изучение способности лимфоцитов человека образовывать розетки с аллогенными гранулоцитами, проводимое у 8-ми. пар доноров, показало отсутствие ро- зеткообразования при использовании алло- генных гранулоцитов. У 8-ми человек изучалась способность лимфоцитов образовывать розетки с гранулоцитами крыс. Лим- фоцитов, образующих розетки с гранулоцитами крыс (ксеногенными гранулоцитами), обдаружено не было. Лимфоциты 8-ми крыс также не образовывали розеток с гранулоцитами человека и с гранулоцитами других крыс, но формировали розетки

с аутогранулоцитами -7,2 ± 0,7 %.

Следовательно лимфоциты образуют розетки лишь с сингенными, а не с алло- и ксеногенными гранулоцитами, поэтому данный способ может применяться для

выявления генетической идентичности индивидуумов, Выявленный феномен взаимодействия лимфоцитов исключительно с аутогранулоцитами объясняется присутствием на поверхностной мембране гранулоцитов молекул НА класса 1, которые считаются молекулами самораспознавания, которые, по-видимому, играют доминирующую роль в данном варианте лимфогрануло- цитарного взаимодействия,.

Таким образом предлагаемый способ позволяет за 5-6 ч определить генетическую идентичность индивидуумов, что, по сравнению с прототипом, в 10-12 раз быстрее. Кроме того, в отличие от прототипа, реализация предлагаемого способа не нуждается в условиях стерильности и в дорогостоящих и дефицитных компонентах, необходимых для длительного культивирования клеток. Формула изобретения

Способ определения генетической идентичности индивидуумов, включающий совместное инкубирование клеток крови исследуемых пациентов и последующее опре деление генетической идентичности, о т л и

чающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, проводят инкубацию лимфоцитов донора с гранулоцитами реци пиента и при наличии розеток констатирую генетическую идентичность.

Изобретение относится к биологии и медицине, точнее к исследованию биологических материалов человека и животных им- мунологическими методами. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа. Сущность изобретения: у лимфоцитов определяют способность образовывать розетки с гранулоцитами и при наличии феномена розеткообразования делают вывод о генетической идентичности доноров лимфоцитов и гранулоцитов. Положительный эффект: применение данного способа значительно упрощает процедуру иммунологи- ческого скрининга донор-реципиент в трансплантологии.