Способ радиометрического определения содержания фосфорибозилпирофосфата в биологических тканях Советский патент 1993 года по МПК G01N33/60 

ел

С

Использование: для определения содержания фосфорибозилпирофосфата в би- ол|эгичёских тканях. .Сущность изобретения: дли определения содержания фосфорибозилпирофосфата проводят реакцию ферментативного синтеза инозинмонофосфата из меченного гипоксантина в присутствии и отсутствии стандарта фосфорибозилпирофосфата, инозинмонофосфата осаждают в виде соли лантана, которую затем растворяют в 0,03 М соляной кислоте, смешивают с сцинтилляционной жидкостью и измеряют скорость образования в ней импульсов. Изобретение позволяет повысить точность анализа фосфорибозилпирофосфата и сократить затраты времени на его выполнение за счет селективного выделения продукта реакции и определения его радиоактивности в гомогенной счетной системе.

Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано в экспериментальной и практической меди- цире, ветеринарии, сельском хозяйстве.

Целью изобретения является повышение точности анализа и сокращение времени егб выполнения.

Способ осуществляется следующим образом.

Взвешивают порцию замороженной тка;ни 100-200 мг и быстро гомогенизируют в кИпящем трис-НС буфере (30 мМ, рН 7,4), добавленном из расчета 1 мл на 100 мг ткани. Сразу же после этого две аликвоты гомо- гецата по 0,5 мл переносят в пробирки, одна из Которых содержит 0,5 мл 0,01 мМ водного рафгвора ФРПФ (служащего стандартом), а другая - 0,5 мл дистиллированной воды. Обе прфбирки нагревают на кипящей водяной бане s течение двух минут, после чего, немедленно охлаждают до 0°С, Охлажденные прббы центрифугируют при 0-4°С и ЮООд в течение 1 мин, после чего каждый из супернатантов смешивают с 1 мл 20 Мм раствора MgCla, содержащего меченный гипоксантин в концентрации 0,025 мМ и инкубируют при 37°С в течение 90 мин. Реакцию останавливают охлаждением пробирок до 0°С и добавлением охлажденных реактивов: К-фосфатного буфера (0,06 М, рН 7,4)-1 мл трис-HCI буфера (0,1 М, рН 7,4)- 6 мл, и 0,5 М водного раствора азотнокислого лантана-1 мл. Осаждают ино- зинмонофосфатприО°С 15 минут, после чего, центрифугируют в течение 10 минут при 0°С и ЗОООд. Полученные таким образом осадки растворяют в 2 мл 0,03 М HCI, отбирают от каждого раствора по 0,6 мл и смешивают с 10 мл сцинтилляционной жидкости Брея. Скорость образования импульсов измеряют на сцинтилляционном счетчике бета-частиц.

Содержание ФРПФ (в моль/г сырой ткани) рассчитывают по формуле

С 100 Сет - С

00

о ю

Сл) Сд5 Я

где Сет - счет пробы содержащей стандарт ФРПФ;

С - счет пробы не содержащей стандарт ФРПФ.

Пример (определение содержания фосфорибозилпирофосфата в крысиной печени).

Взвешивали 150 мг замороженной в жидком азоте крысиной печени, быстро переносили в гомогенизатор и добавляли 1,5 мл трис-НС1 буфера (3.0 мм, рН 7,4), предварительно нагретого до кипения. Гомогени-. зировали в течение 15 с. Две аликвоты гомогената по 0,5 мл немедленно переносили в стоящие на кипящей водяной бане пробирки, одна из которых содержала 0,5 мл 0,01 мМ водного раствора ФРПФ, а другая - 0,5 мл дистиллированной воды. После добавления гомогената обе пробирки кипятили в течение 2-х мин и немедленно помещали в .лед. Охлажденные пробы центрифугировали приО°С и 1000 в течение одной минуты, после чего супернатанты сливали в отдельные пробирки, а осадки отбрасывали. К обоим супер- натантам добавляли по 1 мл 20 мМ оаствора MgCte,.содержащего С-гипоксантин в концентрации 0,025 мМ и инкубировали на водяной бане при 37°С 90 минут. Затем, обе пробирки помещали в лед и в каждую из них добавляли по 1 мл 0,06 мМ К-фосфатного буфера (рН-7,4), по 6 мл (0,1 М трис-НС) буфера (рН-7,4) и по 1 мл 0,5 М водного раствора азотнокислого лантана. Добавленные растворы были предварительно охлаждены до 0°С. Пробирки встряхивали и ломещали в лед на 15 минут, после чего центрифугировали 10 мин при 0°С и 30000. Супернатанты отбрасывали, а к осадкам добавляли по 2 мл 0.03 М раствора HCI и растворяли их при встряхивании. Из каждого раствора брали по 0,5 мл и смешивали с сцинтилляцион0

5

0

5

0

5

0

ной жидкостью Брея. Скорость образования импульса в каждой пробе измеряли в течение одной минуты на счетчике СБС-2.

Получили значения: для пробы содержащей стандарт ФРПФ - 158294, импульса, для пробы без стандарта -12337 импульсов. Подставив эти значения в формулу, получили

12337 100 р 158294-12337 °

Таким образом, во взятом образце печени содержание ФРПФ составляет 8,45 нмоль/г сырой ткани.

Средняя продолжительность анализа по прототипному способу составляет 8 ч 45 мин, по предложенному способу- 2 ч 30 мин величина среднего квадратического отклонения - соответственно 0,458 и 0,255 нмоль/г.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить точность анализа в 1,8 раза и сократить затраты времени на его выполнение в 3,5 раза.

Формула изобретения

Способ определения содержания фосфорибозилпирофосфата в биологических тканях, включающий проведение реакции ферментативного синтеза инозинмонофос- фата из меченого гипоксантина в присутствии и отсутствии стандарта фосфорибозилпирофосфата, выделение меченого инозин монофосфата и измерение его радиоактивности, отличающийс я тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, инозинмонофосфат, выделяют осаждением раствором азотнокислого лантана, осадок соллюбилизируют 0,03 М соляной кислотой, смешивают с сцинтилляционной жидкостью и затем измеряют в ней радиоактивность.