Способ получения антибиотиковметаболитов Советский патент 1977 года по МПК C12D9/00 

Среда

31 049 А/1С889

солодовый

Обильный рост, морщинистая поверхность, янтарная

Умеренный рост, гладкая поверхность, непрозрачная от кремового цвета до оранжевого

Умеренный рост, гладкая поверх-крахмальность, темно-оранжевого цвета

новый агар

Умеренный рост, гладкая поверхность, оранжевого цвета

кстракт-же

Незначительный рост, шероховатая поверхность, темно-коричневая, коричневый пигмент

Обильный рост, твердая поверхность кофейного цвета, слабо-коричневый пи гмент

ой

Обильный рост, твердая поверхность, нигмент оранжевый, рудиментарный воздушный мицелий

ера

Обильный рост, морщинистая поверхность, светло-коричневая пека

Незначительный рост, гладкая поверхность, светло-оранжевая, рудиментарный воздушный мицелий вый агар

Обильный рост, твердая поверхность, интенсивно-оранжевая

Умеренный рост, твердая поверхность, от оранжевого до светло-коричневого

Обильный рост, морщинистая поверхность, от оранжевого до светлокоричневого, рудиментарный воздушный мицелий

Обильный рост, морщинистая поверхность, светло-оранжевого цвета

льция

Умеренный рост, твердая поверхность, от кремового цвета до оранжевого

Обильный рост, морщинистая поокомверхность, интенсивно-оранжевая

Незначительный рост, твердая поверхность, светло-оранжевого цвета

Обильный рост, гладкая поверхность, оранжевая

гар

Очень незначительный рост, гладкая поверхность, полупрозрачная а

Очень незначительный рост, гладкая поверхность, от светло-оранжевого до янтарного цвета

Очень незначительный рост, морщинистая поверхность,, оранжевого цвета

К мьтуральные признаки штамма

31 048 / А6353

Обильный рост, слегка морщинистая поверхность, светло-оранжевый, светлоянтарного цвета

Обильный рост, гладкая, плоская поверхность, светло-оранжевого цвета, несколько спорангиев светло-желтого цвета; пигмент растворимый

Обильный рост, гладкая поверхность, оранжевая, несколько спорангиев светло-желтого цвета; нигмент растворимый

Обильный рост, гладкая поверхность, светло-оранжевого цвета; пигмент растворимый, светло-желтый

Умеренный рост, гладкая поверхность, оранжевая

Обильный рост, гладкая поверхность, розово-янтарная, хорошее образование спорангиев, розово-янтарный пигмент

Обильный рост, гладкая поверхность, светло-оранжевого цвета топаза, хорошее образование больших спорангиев, желтый растворимый пигмент

Обильный рост, гладкая поверхность, розово-янтарная, обильное образование спорангиев

Обильный рост, гладкая тонкая поверхность, оранжевая, обильное образование спорангиев

Обильный рост, гладкая поверхность, оранжевая, несколько спорангиев

Обильный рост, гладкая поверхность, оранжевая

Обильный рост, гладкая-поверхность, янтарного цвета

Обильный рост, твердая поверхность, светло-оранжевого цвета

Очэнь незначительный рост, гладкая поверхность, бесцветная, несколько спорангиев

Обильный рост, слегка твердая повгрхность, интенсивно-оранжевая, желтая, растворимый нигмент

Очень незначительный рост, светлооранжевого цвета, умеренное образование спорангиев

Обильный рост, гладкая поверхность, светло-кремового цвета, умерениоз образование спорангиев

Обильный рост, морщинистая поверхность, интенсивно-оранжевого цвета

Очень незначительный рост, светлооранжевого цвета

Очень незначительный рост, морщинистая поверхность, светло-оранжевого цвета

Штамм Actinoplanes liguriae ЛТСС 31 048 усваивает инозит, фруктозу, рамнозу, ксилозу, арабинозу, мантозу, глюкозу. Не усваивает маннит, рафинозу, целлюлозу, салицин, сахарозу, лактозу.

Штамм Actinoplanes garbadinensis АТСС 31 049 гидролизует крахмал, тирозин, не гидролизует казеин, малеат кальция. Образовывает H2S, меланин, не коагулирует лакмусовое молоко, нитраты восстанавливает, .разжижает желатину.

Штамм Actinoplanes liguriae АТСС 31 048 гидролизует крахмал, казеин, не гидролизует тирозин, малеат кальция, меланин; HgS не образует; не коагулирует и не пентонизирует лакмусовое молоко; нитраты не восстанавливает; желатину не разжижает.

Для -получения новых антибиотиков штаммы выращивают в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли. Штаммы обычно подвергают предварительному выращиванию в качалочной колбе до получения значительного количества антибиотиков, иосле чего культурой засевают питательную среду в ферментере.

Выращивание продолжают три температуре 25-35°С в аэробных условиях до получения значительного количества антибиотиков. Контроль за концентрацией антибиотиков осуществляют диффузионным методом на атаре с по.мощью Sarcina lutea в качестве испытуемого микроорганизма.

Полученные антибиотики выделяют из ферментационной жидкости обычными приемами, например экстракцией органическими растворителями, в которых антибиотики нерастворимы и которые не смещиваются с водной средой, такими как Сз-Се-алканолы и (Ci- С4)-низщие галоидированные углеводороды.

Органическую фазу отделяют от водной среды, концентрируют до небольщого объема и выдерживают 10-15 ч при низких температура.х. Вынавщий осадок затем отфильтровывают.

Бумажной хроматографией или тонкослойной хроматографией сырого продукта через силикагель и последующим микробиологическим развитием с помощью Staphylococcus aureus обнаруживают два активных комлонента - метаболиты А н В, причем цоследний в больщем количестве.

Метаболиты Л и Б отличаются друг от друга величиной Rf, находящейся в зависимости от системы растворителей.

Метаболиты А к В очищают и выделяют Обычными приемами, например противоточной экстракцией в системе растворителей, в которой .метаболиты и.меют разные коэффициенты распределения. Метаболит В получают в виде мононат.риевой соли, которая может превращаться в другие соли с щелочными или щелочноземельными металлами или в свободную кислоту, обычными приемами.

Метаболиты А, В (гардимицин) и их соли

с щелочными и щелочноземельными металлами, а также метаболит С оказывают хорощее .бактерицидное действие in vitro и in vivo, в частности гардимицпн оказывает отличное действие in vitro на грамположительные бактерии при концентрации 1-50 мкг/мл. Гардимицин действует на изолированные в клинических условиях штаммы Streptococcus.

Кроме того, градимицин проявляет сильное действие in vivo на инфекции у мышей, пораженных бактериями родов Diplococcus и Streptococcus. Он имеет очень низкую токсичность: LDso выще 1000 мг/кг внутрибрюшинно и около 200 мм/кг внутривенно.

Пример 1. Для получения антибиотиков щтамм Actinoplanes garbadinensis АТСС 31 049 -подвергают предварительному выращпванию в аэробных условиях в питательной среде до достижения значительного количества антибиотиков. Культура, выращиваемая на качалке, .может быть следующего состава, .г/л:

Мясной экстракт3,0

Дрожжевой экстракт10,0

СаСОз4,0

Крахмал25,0

Водопроводная водаДо 1000 (мл)

Колбы встряхивают 24 ч при температуре 28-30°С, затем предварительными культурами (1 л) засевают ферментеры, содерл ащие 1.0 л питательной среды следующего состава, г:

Мясной экстракт40

Пептон40

Дрожлсевой экстракт10

NaCl25

Мука из соевых бобов100

Глюкоза500

СаСОз50

Водопроводная водаДо 1000 (мл)

Питательные среды засевают в аэробных условиях с перемещиванием при температуре 28-30°С. В определенных интервалах контролируют количество образующихся антибиотиков методом диффузии с помощью Sarcina lutea в качестве тест-микроба. Максимальное образование антибиотиков достигается через 96--120 ч.

Ферментационную ж:идкость доводят до значения рН 8,0, затем фильтруют с помощью Hyflo super-cell в качестве вспомо.гательного фильтрующего средства. Мицелий выбрасывают и фильтрат экстрагируют бутанолом (половиной объема фильтрата). Органическую фазу отделяют от водной, а затем лосле промывания подкисленной водой (рН 4,0) кон; нтрируют до 1/10 объема и выдерлсивают 10- 12 ч при 3-6°С.

Осадок, полученный на фильтре, промывают бутанолом и высушивают под вакуумом при комнатной температуре. Выход 3,0 г. Хро.матографией с помощью -бумаги пли на силикагеле и последующим проявлением пятен с помощью тест-микроба Staphylococcus aureus обнарул-сивают два компонента с различными значениями в зависимости от растворителей -