тичному гидролизу рестриктазой ЗаиЗА путем инкубации 10, мкг ДНК плазмиды с 20 ед. фермента в общем объеме смеси 100 мкл, содержащей 25 тМ калий-фосфатного буфера рЫ 7,0, 50 mM NaCI, 15 тМ MgCla, f тМ 2-меркаптоэтанола, 0,02% тритона Х100 в течение 1 мин при 37°0. Полученную смесь обрабатывают фенолом, ДНК из водной фазы осаждают добавлением 10 мкл. Na-ацетата (рН 8,0) в 200 мкл этанола, ДНК растворяют в 100 мкл буфера, содержащего 10 тМ трис-НС (рН 8,0), 2 mM MgClsi, 20 тМ NaCI, 100 мкг/мл альбумина, 0,02% тритона . Х100, инкубируют в течение 1 часа при37°С с 30 ед. рестриктазы Sph I. Полученную смесь фракционируют электрофорезом в 0,7% геле легкоплавкой агарозы. Фрагмент ДНК размером 12 - 14 т.п.н. элюируют путем расплавления полосы геля при 65°С, экстракция агарозы фенолом-и осаждения этаншюм. Осадок ДНК растворяют в 10 мкл воды.
5 мкг ДН К плазмиды pBR 325 обрабатывают 10 ед. рестриктазы Sph в общем объеме смеси 50 мкл (состав описан, выше) в течение 1 часа при 37°С. После обработки фенолом и переосаждения ДНК .этанолом смесь растворяют в 50 мкл буфера, содержащего 6 тМтрис-HCipH 7,9.6 mMMgCla, 150 тМ 0,02% тритона Х100. и инкубируют с 10 ед. рестриктазы BamHl 1 час при 37°С. Фрагмент ДНК размером 5,3 т.п.н. элюируют после фракцжжирования электрофорезом в.0,7% гепе легкоплавкой агарозы, ДНК
растворяют а 10 мкл воды,
3 мкл раствора ДНК лйнеаризованой плазмиды pBR 32Б сливаю с 10 мкл раствора фрагмента плазмиды р1, содержащего гены синтеза микроцина, добавляют 1,5 мкл буфера (0,5 М трис-HCI рН 7,9, 0,1 М MgCla. 0,1 М DTT, 1 mM АТР) и 1 мкл липазы и инкубируют 3 часа при 16°С. . Ллазмиду передают методом трансформации в клети штамма Е. coli ТС,й Е. colt М17. Для этого в полученной лигазной смеси добавляют 100 мкл компетентных клеток соответствующего штамма, инкубируют 30 мин при 4°С, затем 2 мин при 42°С, до.бав- ляют 1 мл 1 бульона и инкубируют Т час при 37°Ci 200 мкл суспензии клеток высевают на
.чашки с агаризованной L-средой, еоДержа- щей 100 мкг/мл ампициллина и инкубируют при 37°С в течение ночи.. ;
П р и м е р 2. Построение физической карты плазмиды pNК 34..
1 - 5 мкг ДНК плазмиды подвергают гидролизу соответствующей рестриктазой в условиях, рекомендованных заводом-изготовителем. По окончании гидролиза смесь
фрагментов ДНК обрабатывают фенолом (рН 7,0) и осаждают этанолом. Для последующего гидролиза ДНК растворяют в буфере, рекомендованном для соответствующей рестриктазы. Смесь фрагментов ДНК фракционируют в 0,7% агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 2-3 в/см.
П р и м е р 3. Проверка способности штаммов Е. coli (pNK 34)синтезировать мин- кроцин.. ...
Колонии штамма выращиваю уколами на среде следующего состава (г/л Н20): МааНРОз - 7,5; КНаРСм - 1,5; (NH4)2S04 - 2, МдЗОз - 2, обогащенной дрожжевым экстрактом (Dlfco, 0,3%) .в течение 1 - 2 суток при 37°С, Затем клетки убивают парами хлороформа, накладывают целлофан и сверху засевают индикаторный штамм Е. coJi В в. 3,0 мл 0,7% агара (1 - 2 107 клеток из. экспоненциальной фазы роста культуры). Вокруг колоний, синтезирующих микроцин, наблюдаются зоны задержки роста индикаторного штамма через 12 - 18 ч инкубации
при 37РС.;/К-;:. :СЙ Й;| :5;::-- ; .. :
ДскгтигнутьгЙ Положительный эффект илл острируётЬя а:нйымитаблиц ы. :;. Диаметр зон, образуемых вокруг колоний штаммов Е. со) TGI и М17, содержащих плазмиду pNK34i был в 2 -2,5 раза больше, чем диаметр збн:6Ькруг колоний, содержащих плазмиду ТЦ/СТабл.). . - ...... .; . -.
Увели Цйе Диаметра ззоны задержки роста в 2 раза бвийётельстеует об увеличении уро вйяйинтёза мйкроцина. .: Та ким обра ёОм , полученная рекомби- нантная плазмйДа pNK 34 определяет повы- шенный уровень|..синтеза микроцина по сравнёнйю с плазмйдой р74. Эта плазмидэ может быть использована для конструирования штаммов, применяемых для борьбы с кишечными заболеваниями человека и сель- скохозяйственкь/х животных; антагонистическое действие этих штаммов будет усилено благодаря повышению уровня синтеза микроцина. Кроме того, штамм, несущий плазмиду pNK 34, может быть использован как новый продуцент антибио,- тического вещества с антибактериальным, действием широкого спектра - микроцина. ;
Ф о р мул а йз о бретён и я . :.;;
Рёкомбинантная плазмидная ДНК pNK 34, кодирующая синтез микроцина, размером 17,8Т.п.н., содержащая -Sph- BamHI- фрагмент ДНК вектора pBR 325 размером 5,.П; н.; Sau ЗА - Sphl-фрагмент плазмиды р1 размером 12,5 т.п.н., включающий гены синтеза микроцина и иммунитет к нему; уни
кальные сайты: Sphl, BamHI, SalGI; генети-тез микроцина, ген, определяющий иммуни- ческие маркеры; ген Ыа, обеспечивающийтет к микроцину, неконьюгативна, стабиль- синтез р-лактамазы, ген, кодирующий син-на в 100% клеток при 100 генерациях.
