Способ получения биологически активной фракции из спермы животных Советский патент 1993 года по МПК A61K35/52 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биоло- гически активных средств из сырья животного происхождения.:

Целью изобретения является повышение качества целевого продукта за счет устранения иммуногенных свойств средства, получаемого из спермы, путем удаления высокомолекулярной составляющей.

Для достижения цели в способе получения биологически активного средства.из спермы, которую сначала подвергают термической обработке, затем получают растворимую фракцию, которую, разделив на высокомолекулярную и низкомолекулярную фазу, стерилизуют и концентрируют до получения целевого продукта, предложено в качестве сырья использовать как нативную, так и криоконсервированную сперму, которую-сначала инкубируют при температуре в течение 0,5-1 часа при перемешивании и отстаивают в течение 5-15 часов при температуре 15-25°С, а растворимую фракцию разделяют методом диализа или колоночной хроматографии, причем в качестве целевого продукта стерилизуют соответственнодиализат или низкомолекулярную фракцию.

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения способа (примеры 1-5) и испытаний нового биологически активного средства (пример б).

П р и м е р 1. 50 мл нативной спермы, полученной от быков-производителей, вносят в стеклянный стакан, снабженный мешалкой, и инкубируют в течение 30 мин. при температуре 80°С. Скорость перемешивания 120 об/мин. После окончания нагрева

смесь выдерживают при температуре 25°С в течение 5 часов при периодическом перемешивании. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием при 5000 об/мин. Полученную растворимую фракцию помещают в целлофановый мешок (гидратцеллю- лозные мембраны для гемодиализа Диацелл ТУ 6-06-475-80 производства Ба- лаковского ПО Химволокно). Диализ проводят против дистиллированной воды, в соотношении 1:1 при температуре +4 С, в, течение 24 часов. Диализат, содержащий вещества с молекулярной массой не более 1 кДа, стерилизуют ультрафиолетовым облучением и лиофильно. высушивают.

П р и м. е р 2. 250 мл спермодоз (50 млЈ разбавленной в защитной среде спермы, вносят в стеклянный стакан, снабженный мешалкой, и размораживают при комнатной температуре. Размороженныф спермо- дозы инкубируют при перемешивании со скоростью 120 об/мин, в.течение 60 мин,, при температуре 90°С. После прекращения нагрева смесь выдерживают при температуре 15°С при периодическом слабом перемё-. шивании в течение 15 часов. Образовавшийся творожистый осадок удаляют центрифугированием при 5000 об/мин. Полученную растворимую фракцию диализуют, как описано в примере 1, а диализат, содержащий вещества с молекулярной массой не более 1 кДа, облучают ультрафиолетовым светом и лиофильно высушивают,

П р и м е р 3. 250 спермодоз (50 мл) разбавленной в защитной среде спермы вносят в стеклянный стакан, снабженный мешалкой, и подвергают размораживанию при комнатной температуре. Размороженные спермодозы инкубируют при перемешивании со скоростью 120 об/мин, в течение 60 мин, при температуре 90°С. После прекращения нагрева, смесь выдерживают при температуре 15°С, при периодическом слабом перемешивании 15 часов. Образовавшийся творожистый осадок удаляют фильтрованием. Фильтрат лиофильно высушивают, растворяют в физиологическом растворе до концентрации 100 мг/мл и наносят на колонку, заполненную сефадексом марки G-15 (Pharmacia). Элюцию проводят физиологическим раствором. Высокомолекулярную составляющую, выходящую со свободным объемом колонки, отбрасывают. Низкомолекулярную составляющую (элюат) с молекулярной массой ниже 1 кДа стерилизуют ультрафиолетовым облучением и лиофильно высушивают.

П р и м е р. 4. 250 спермодоз (50 мл) размораживают, инкубируют, отстаивают, фильтруют и концентрируют как указано в примере 3. Колоночную хроматографию осуществляют на молселекте марки G-10 (Reana). Стерилизацию и лиофильное высушивание целевого продукта осуществляют как указано в примере 3.

П р и м е. р 5. 250 спермодоз (50 мл)

размораживают, инкубируют, отстаивают, фильтруют и концентрируют как указано в примере 3.

Колоночную хроматографию осуществляют на биогеле марки Р-4 (Bio-Rad).

5 Стерилизацию и лиофильное высушивание целевого продукта осуществляют как указано в примере 3.

П р и м е р 6. Для проверки иммуноген- ности полученного средства из диализата

0 спермы проводят иммунизацию кролей спермой и диализатом ее с адъювантом Фрейнда. Инъекции осуществляют внутри- кожно во множественных местах с двухнедельным интервалом в течение 2 месяцев.

5 Забор крови проводят на 8-й день после последней инъекции из ушной артерии или Ъены. С Помощью метода двойной радиальной иммунодйффузии в теле было проведено -тестированиеполученных

0 антисывороток. 1,5%-ный раствор агара в 0,05 М трис-барбитуратном буфере.(рН 8,0) с 0,15 М NaCI заливают на обезжиренные, строго горизонтальные стекла, до получения слоя толщиной примерно 1,5 мм. В за5 твердевшем теле по шаблону вырезают центральное отверстие - лунку, а вокруг него еще 6 лунок, так чтобы расстояния между ними составляли 5-10 мм. Луики вырезают трубочками с острыми краями диа0 метром 3-4 мм гель из них удаляют отстаиванием, Лунки до края заполняют соответствующими растворами. В центральную лунку наливают разбавленную антисыворотку, полученную из крови кро5 лей, прошедших иммунизацию диализатом

спермы. В периферические лунки - серию

разбавлений исходного раствора диализата

спермы. Антисыворотку и диализат спермы

разбавляют физиологическим раствором.

0 Это делается для подбора оптимального соотношения их концентраций. Иммунодиф- фузию ведут во влажной камере при комнатной температуре в течение 2 дней. По окончании процесса иммунодйффузии по5 лосы преципитации обнаружены не были как визуально, так и при окрашивании красителями типа Кумасси ярко-голубой бриллиантовый R-250. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии иммунного ответа организма на диализат спермы. Преимущество нового способа по сравнению с известными аналогами заключается в создании простого способа получения из на- тивной и криоконсервированной спермы биологически активного средства, которое не вызывает иммунногенных реакций, что экспериментально доказано.

Формула изобретения Способ получения биологически активной фракции из спермы животных, включающий термическую обработку сырья, центрифугирование, фильтрацию надоса- дочной жидкости с последующей стерили0

зацией и концентрированном целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта за счет устранения иммуногенной активности, в качестве сырья используют дополнительно криоконсервмрованную сперму, термическую обработку проводят при температуре 80-90°Св течение 0,5-1 ч при перемешивании, отстаивают при 15-25°С в течение 5-15 ч, надосадочную жидкость разделяют на фракции путем диализа или колоночной хроматографии, выделяют фракцию, содержащую целевой продукт, с мол. мае. не более 1000 дальтон.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к способам получения биологически активных средств из сырья животного происхождения. Цель изобретения -устранение иммуногенных свойств целевого продукта, .получаемого из спермы. Способ включает следующие операции: термическая обработка спермы, получение растворимой фракции, разделение на высоко-и низкомолекулярные составляющие, стерилизация и концентрйрование до получения целевого продукта. Новым в способе является использование в качеств сырья не только нативной, но и криоконсёрвированной спермы, которую инкубируют при температуре 80-00РС в течение 0,5-1 ч при перемешивании, отстаивание 5-15 ч при 15-25°С, разделение на высоко- и низкомолекуляр-; ные составляющие путем диализа или колоночной хроматографии, причем в качестве целевого продукта стерилизуют соответственно диализат или низкомолекулярную составляющую. ел с