Изобретение относится к биологии и касается способа снижения гетерогенности секретированных моноклональных антител.
Крупномасштабное производство моноклональных антител из клеток гибридом вызвало революцию в прогнозе, диагностике и лечении различных болезненных состояний, Моноклональные антитела также полезны в определении стадий различных природных состояний, таких как беременность. Однако, было установлено, что многие полученные из гибридов антитела проявляют гетерогенные формы, которые сильно мешают процессам очистки и выделения, необходимом для достижения высоких выходов из промышленных штаммов. Катионнообменная хроматография показывает, что существует, по меньшей мере, три дискретных гетерогенных формы антитела, выделенного из клеток, выращенных ин вит- ро. Эти формы могут появляться в различных относительных количествах. Эти
гетерогенные формы не обнаружены в таком же количестве в асцит-выделенных антителах, хотя производство высоких уровней антител из асцитов намного более трудоемкий и дорогой процесс для коммерческих целей.
Биохимическая основа для этой гетерогенности возникает из наличия избыточной аминокислоты или кислот, присоединенной к карбокси-окончанию тяжелых цепей антитела. Терминальная аминокислота наиболее вероятно удаляется во время внутренней обработки или выделения антитела из клетки, тогда как предполагаемая последовательность аминокислот, полученная из ДНК-последовательности гена антитела, действительно содержит дополнительную аминокислоту. Одной из этих трех гетерогенных форм является антитело, которое не содержит дополнительной терминальной аминокислоты в любой из своих тяжелых цепей. Вторая из трех дискретных гетероы
ел о о
w
генных форм содержит дополнительную аминокислоту в одной из своих тяжелых цепей, в то время как третья форма содержит дополнительные аминокислоты в обеих тяжелых цепях.
Настоящее изобретение включает способ специального отщепления дополнительной аминокислоты от тяжелых цепей гетерогенных антител, тем самым превращая все три формы в одну, по существу, чистую, гомогенную смесь. Разработка и применение технологии моноклональных антител зависит от доступности больших объемов по существу гомогенных антител. Эта разработка в какой-то степени сдерживается невозможностью легкой очистки и характеристики различных гетерогенных форм выделенных антител. Настоящее изобретение полезно и особенно важно в том, что оно позволяет преобразовать большинство гетерогенных антител в одну по существу гомогенную форму перед очисткой. Это преобразование приводит к высокому выходу антитела с более определенными биохимическими характеристиками, а также к снижению загрязнения гетерогенными формами антитела при очистке. Более того, обладание сверхчистыми одноформными антителами значительно увеличивает ре- продуктивность и логичность последующих модификаций, таких как реализации имму- ноконъюгации или иммуномобилизации.
Способ снижения гетерогенности выделенных антител включает добавление кар- боксипептидазы в культуральную жидкость, содержащую выделенные антитела при СР1Р соотношении, достаточном для снижения гетерогенности указанных антител, затем выращивании культуральной жидкости в течение определенного времени и при температуре и рН, достаточных для редукции гетерогенности антител.
Способ осуществляется следующим образом.
П р и м е р 1. Культура гибридомы СЕМ231.6.7.
Гибридому СЕМ231.6.7, которая выделяет моноклональное антитело СКМ231, получают из АТСС (Американской коллекции типов-культуры) 12301 Парклоун драйв, Роквил, Мэриленд 20852, Гибридома СЕМ 231.6.7 является частью коллекций штаммов ТСС и доступна специалистам как источник и вместилище штаммов антитела под номером АТСС НВ9620. Замороженные клетки быстро размораживают, затем сразу промывают 10мл среды HLI, дополненной 4 мМ глутамина. Среда HLI поставляется фирмой Вентрекс из Портланда, гр.Мэйн. Клетки помещают в Т-колбу и выращивают до достижения высокой концентрации клеток.
Вращающиеся 250 мл колбы, содержащие среду HLI, дополненные 4 мМ глутами5 на, засеяли 300000 клеток/см СЕМ 231.6.7, которые выделяли антитело. Эти клетки выращивали при 37°С 48 ч до достижения концентрации клеток 900000 клеток/мг. Затем в каждую вращающуюся колбу добавили
Ю другую аликвоту глутамина для доведения конечной концентрации культуры до 4 мМ глутамина. Вращающиеся колбы, содержащие клетки СЕМ 2.31.6.7, затем выращивали при 37°С еще 8-10 суток.
15 После конечного выращивания клеточную культуру вылили в две 250 мл колбы и центрифуговали при 10000 оборотах/минуту 12 мин в роторе Beckmann IA8 на центрифуге. Выделили около 375 мл супернатанта
20 и предварительная количественная оценка показала, что концентрация антитела составляла около 80 мкг/мл. Культуральную среду затем концентрировали до 40 мл, используя 400 мл перемешиваемый концент25 ратор клеток, снабженный фильтром УМ10 76 мм (производство Amlcqn Corporation, Sclentific.Syg, что после 24 часов более 80% антител превратились в первичную гомогенную форму, в то время как контрольные про30 бы, выращиваемые без асцитической жидкости остались почти эквимолярными во всех трех гетерогенных формах.
Пример 4. Преобразование антитела СЕМ 231, используя способ СР.
35 Примерно 5 мг аликвоты концентрата антитела СЕМ231 выращивали при 22-23°С 5 ч с 50 мкг карбоксипептидазы В. Карбок- сипептидазу В представляет Calllochem P.O. Box. 12087, Sor. Diego California 92112
40 и она имеет ферментную активность 295 1/мг. Следовательно, эта реакция соответствует ОР1Р соотношению 3,0. После 5-часового выращивания, гетерогенность пробы оценили катион-обменной хроматографией
45 на колонке Mono-SHR 5/5, рН 4,5 в 0.17М буфере ацетата натрия с градиентом 0,0-0,2 М NaCl. Экспериментальные данные показали, что более 95% антител в пробе преобразовались в первичную гомогенную форму,
50 в то время как необработанные антитела сохранили почти эквимолярное соотношение гетерогенных форм.
Формула изобретения Способ снижения гетерогенности сек55 ротированных моноклональных антител путем отщепления аминокислоты или аминокислот от карбоксиконца одной или обеих цепей моноклональных антител посредством добавления карбоксипептидазы В в культуральную жидкость, продуцирую
щую моноклональные антитела при соотно- инкубирования смеси в течение 5 ч, пырящи- шении секретированные гетерогенные мо- вания при температуре 22 23fJC и выделе- ноклонэльные антитела: фермент 1001:1. нии целевого продукта в гомогенной форме.
Использование: изобретение относится к области биологии и касается способа снижения гетерогенности секретированных мо- ноклональных антител. Предложение является пионерским. Сущность изобретения заключается в обработке культуральной жидкости, продуцирующей моноклональ- ные антитела карбоксипептидазой В при соотношении секретированные гетерогенные моноклональные антитела: фермент 100:1, инкубировании смеси в течение 5 ч. выращивании при температуре 22-23сС и выделении целевого продукта в гомогенной форме. Положительный эффект предложения заключается в получении гомогенных антител, которые можно выделить в чистом виде гель-фильтрацией.
