Штамм бактерий ТнеRмUS тнеRморнILUS - продуцент ДНК-полимеразы Советский патент 1993 года по МПК C12N9/12 C12N1/20 

Дезинтеграторе с амплитудой 18 мк в тече- ие 30 мин с 30 с паузами, охлаждая льдом, атем гомогенат центрифугируют для осаж- ,ения дебриса при 100000д 1,5 ч. В супер- атанте определяют активность НК-полимеразы, которая составляет 45 д/мг белка.

2.2.Супернатант после центрифугиро- t ания наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюло- ой (Ук 50 мл). Элюцию проводят инейным градиентом (400x400 мл) 0,01- ,25 М NaCI в 10 мм трис-HCI, рН 7,8. Соби- ают фракцию, выходящую при 0,15 М NaCI. змеряют активность ДНК-полимеразы. алее белковую фракцию наносят на колон- у с фосфо-целлюлозной (VK 37,5 мл), урав- новешенную КФ буфером (10 мм 2НР04-КН2Р04 рН 7,0, 1 мм ЭДТА). Прово- ят элюцию градиентом (200х200/мл) 0,1- ,6 М NaCI на КФ.

Собирают фракцию, выходящую при 1,33 М NaCI, измеряют активность ДНК-пол- амеразы. Далее фракцию наносят на колон- i у с ГАПом (гидроксилаппатит) (VK 9,6 мл), равновешенную КФ, и проводят элюцию градиентом(50x50 мл)0,02-0,2 М КФ. Соби- ают фракцию, выходящую при 0,33 М NaCI,

(

змеряют активность ДНК-полимеразы. Да- ее фракцию наносят на колонку с ГАПом

идроксилаппатит) (VK 9,6 мл), уравнове- иенную КФ, и проводят элюцию градиен- (50x50 мл) 0,02-0,2 М КФ. Собирают кцию, выходящую при 0,15 М КФ, Измеряют активность ДНК-полимеразы. Далее ракцию диализуют в течение ночи при тем- ературе+4°С против буфера, содержащего О мм КФ рН 7,0, 100 мм NaCI, 0,5 мм ЭДТА, мм ДТТ, 50% глицерол. Измеряют актив- ость фермента, которая практически не из- еняется по сравнению с активностью осле очистки на ГАПе.

Стадии очистки и значения активности НК-полимеразы суммированы в табл.1.

3.Изучение термостабильности ДНК- олимеразы из Thermus thermophilus КТП. Фермент прогревали в течение различного времени при температурах 92 и 95°С и

измеряли его активность. Результаты приведены в табл.2.

Как видно из табл,2, фермент сохраняет свою активность в течение 1,5 ч при 92°С и в течение 1 ч при 95°С, что позволяет более эффективно использовать его в методе ПЦР.

Пример 2. Проверка температурного оптимума функционирования ДНК полиме- разы из Thermus thermophilus КТП. 010 г биомассы Thermus thermophilus КТП суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ NaCI, 25 мМ трис-HCI, рН 7; 9,2 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,001 М ЭДТА, клетки разрушают ультразвуком при охлаждении 5 льдом, клеточные стенки осаждают центрифугированием при 16000д. Из надосадоч- ной жидкости ДНК-полимеразу очищают хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе, фосфо- целлюлозе, оксиапатите. Тестирование фермента во фракциях проводят по включению дезокси ( Н)д ТТФ в ДНК, активированную ультразвуком, в реакционной смеси (20 мкл), содержащей 0,25 о.е. ДНК, 1 мкм дезоксинуклеотидтрифосфатов, 5 пико- моль (3Н)д ТТФ, 25 мМ Трис-HCI рН 8.3, 10 мМ МдСЪ, 5 мМ ДТТ и фермент. После завершения реакции кислотонерастворимый продукт переносят на фильтры, радиоактивность подсчитывают в сцинтилляционном счетчике.

Результаты эксперимента изложены в табл.3.

Данные эксперимента показывают, что оптимум температуры функционирования ДНК-полимеразы лежит выше 70°С.

Таким образом, как показано, предлагаемый штамм Thermus thermophilus КТП не содержит рестриктазы, что облегчает выделение и очистку ДНК-полимеразы. (56) I.Eur.l.Biochem.- 1985, v.149, N; 1, р.41- 46.

2.FEBS Lett. - 1980, v.109, № t, p.156- 563.

5 3.Авторское свидетельство СССР Ms 1830944, кл. С 12 N 9/12. 1989.

5

0

5

0

Таблица 1

Формула изобретения Штамм бактерий Thermus thermophilus

Таблица 2

Таблица 3

ВКПМ В-4892 - продуцент ДНК-полимера- зы.