СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИТАМИНА В (РИБОФЛАВИНА) Советский патент 1969 года по МПК C12P25/00 

Известны способы получения витамина В₂ (рибофлавина) путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов - сверхсинтетиков этого витамина на питательных средах, содержащих различные источники углерода. К таким микроорганизмам относятся, например, дрожжеподобные грибы аспорогенные дрожжи (Candida), ацетогобутиловые бактерии.

Некоторые из этих микроорганизмов (Eremothecium) характеризуются сложными питательными потребностями, другие (Candida, ацетонобутиловые бактерии) - чувствительностью даже к низкому содержанию солей железа в среде (угнетается сверхсинтез рибофлавина).

Предлагаемый способ отличается от известного тем, что в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Bacillus subtilis RFI. Он характеризуется тем, что будучи прототрофом растет на простых по составу питательных средах и не нуждается в сложных азотистых добавках как для роста, так и для сверхсинтеза рибофлавина. На процесс сверхсинтеза рибофлавина этим штаммом не влияет высокая концентрация солей железа в среде.

Штамм RFI был получен УФ-облучением культуры прототрофного штамма Bacillus Subtilis SHgW (Marburg). Он характеризуется следующими основными признаками. Тонкие энергично подвижные палочки, одиночные, парные и в цепочках; образуют овальные споры. Размер клеток 2,5-3×1,26 мк, размер опор 1,6×1,25 мк (в препаратах, приготовленных из двухсуточных колоний на мясо-пептонном агаре). Аэроб хорошо растет на мясных и синтетических средах, содержащих в качестве источника азота одно из следующих азотистых соединений: (NH₄)₂ SO₄, KNO₃, аспарагин, глютаминовую кислоту, пептон, аланин. В качестве источников углерода, наряду с глюкозой, можно использовать сахарозу, фруктозу, арабинозу, мальтозу, сорбит, маннит. На минеральных средах с указанными выше источниками азота и углерода выделяет в среду рибофлавин.

Способ заключается в следующем. Выращивают штамм RFI на содержащей фосфаты калия, магний, натрий, источник углерода (сахар) и азота минеральной среде либо на качалке, либо стационарно. В последнем случае на поверхности среды образуется бактериальная пленка. Спустя 18 час начала выращивания среда начинает желтеть от присутствия в ней рибофлавина. Синтез витамина В₂ при этом достигает 100 и более γ/мл.

Из среды, на которой культивировали микроорганизм, рибофлавин извлекают любым известным способом.

Пример. Культуру Bacillus subtilis RFI выращивают на модифицированной среде Спицайзена следующего состава (на 1 л дистиллированной воды в г): K₂НРО₄ 14; KH₂PO₄ 6, (NH₄)₂ SO₄ 2, цитрат Na₂H₂O 1. Полученную среду стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 20 мин. Затем вносят 0,2 г MgSO₄·7H₂O и 0,5% (или более) источника углерода, например глюкозу, предварительно простериллизованные в отдельности.

С увеличением количества вносимого углерода увеличивается выход витамина, но замедляется процесс. Так, на среде с 1,5% глюкозы при 37°С и аэрации среды (качалка) за 66 час накапливается в среде до 90 γ/мл витамина В₂, а на среде с 3% глюкозы - 108 γ/мл, но за более длительный период.

При добавлении в среду 120 γ/мл FeSO₄ (в расчете на железо), синтез рибофлавина не снижается.

Способ получения витамина В₂ (рибофлавина) путем выращивания продуцирующего, его микроорганизма на питательной среде, содержащей в качестве источников углерода сахара, при аэрации среды с последующим извлечением витамина одним из известных способов, отличающийся тем, что., с целью упрощения состава питательной среды, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Bacillus subtilis RFI.