СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОТИДОВ ИЛИ ОЛИТОНУКЛЕОТИДОВ Советский патент 1969 года по МПК C07H19/02 C07H21/00 

Известен способ цолучения уридилил-(3- )-уриди1на, заключающийся в том, что уридин-5-фосфат подвергают взаи модействию с ди:циклогексилкарбодии МИДОМ; полученный при этом уридин-3-5-фосфат циклического строения обрабатывают дигидротаропаном в среде диоксаыа, образующийся 2-О-тетрагид.ропираниловый эфир гидролизуют при .нагре,вании .в гидроокиси бария. Полученную смесь 3- и 5-фосфатов обрабатывают трифенил-метилхлоридом в пирцдине, при это.м выделяется только З-фосфорное .производное, которое конденсируют затем с 2,3-ди-О-ацетилуридином, после чего полученный продукт обрабаты.ваюг щелочью или кислотой.

С целью упрощения и удешевления технологии Процесса иредложен способ получения нуклеотидов или олигонуклеотидов на основе природных и аномальных нуклеозидов, состоящий в том, что нуклеозид или смесь нуклеозидов подвергают взаимодействию с фосфатом щелочного металла в соотношении 1 : 1 -10, Преиму1цсственно 1 : 5, при температуре 155- 165° С с .последующей хроматографией полу ;p.ннoй смеси и выделением отдельных нуклеотидов или олигонуклеотидов в чистом виде. Р (Качестве аномальных нуклеозидов ц-рименяют 6-азаурИдин, 6-азацитидин, 5-оксиу.ридин, урацилксилозид, туберцидин.

ПрИМСр 1. 3.6 г уридина и 11,7 i КаП2Р04 раствс.ряют в дистиллированной воде и сушат по методу вымсраживан1 я в колбе. Колбу до горлышка погружают в баню, обогреваемую при температуре 160 С. После нагревания реакционной смеси в течение 1 час ее охлаждают и растворяют в воде. Затем отфильтровываю незначительное количесгво иерастворившихся продуктов и разделяют смесь с помощью :колош и, заполненной слабокислой ашюнообмеиной смолой, по фогрмиатнсму циклу посредством градиентного элюирования по стандартизированной градиентной системе (муравьиная .киелота: муравьиная .кислота+формнат). Фракции собирают в автоматически действующий сборник, после чего находят состав вещества путем определенпя ультрафиолетового поглощенпя при 260 ммк. Далее объединяют соответствующие фракции по графику извлечения, концентрируют их, отдельные вещества осаждают в виде бариевых солей при о.хлаждении льдом, обрабатывают последовательно охлажденными спиртом, смесью этилового спирта с эфиром, эфиром, а затем сушат иродукт над пятиокисью фосфора (фосфорным ангидридом).

Уриднлпл-(2---5)-уриднм н хздндилил-(У- -5)-уридин (7%)

У р ид нн - 3 - ф о с ф а т (15%)

Уридин-о-фосфат (15%)

Кроме тото, получают 35% уридина в виде чистой фракции.

Общий выход всех фосфорилирсватпях по.щест.в 62%.

Пример 2. 500 мг 6-азауриди,н-4,5-иС и G20 мг NaH2PO42H2O растворяют в 2 мл дистиллированной воды и сушат в небольшой проби.рке ио методу в)1мораживания. -/,; этой пробирки погружают в баню, обогре-васмую при те.мпературе 160 С и иа гревают 0,5 час. ПоСле охлаждения реакционную смесь растворяют в 0,5 Л1л воды и наносят на ли€т бумаги, применяемой для хроматографирования. Осуш,естБляют нисходящее хроматопрафирование с использованием смеси - изолгасляная кислота :аммиа.к:вода (66:32,5:1,5).

Далее удаляют растворитель из -бумаги, обдувая ее воздухом, имеющим температуру лабораторного иомещения.

Для обнаружения веществ используют автоматически действующую апиаратуру для определения распределения активности на .полосках хроматограммы. По€ле определения зон отдельные полоски хроматопрамлгы непрерывно элюируют водой, и экстракты, выделенлые из адсорбента, повторно хроматографируют, Применяя смесь изопропанол : аммиак : вода (7:1: 2). Очищенные указанным путем вещества элюируют водой и лиофизируют. При этом получают следугощие вещества.

6-Азауридилил- () -6-азауридин

6-Азауридилил- () -6-азауридин

6-АзаурИ|Дин-3-фосфат

6-Азауридин-5-фос({)ат

Кроме того, получают 6-азауридип

П р и м е р 3. 3 мг 6-азаури-дин-4,5-11С и 3 мг б-азацитиди«а смешивают с 20 мг Nan2P04X Х2П20 и лагревают IB пробирке при температуре 160° С в течение 15 мин, причем в баню для обогрева погружают 2/з пробирки. По окончании реакции смесь наио,сят на хроматографичеокую бумагу и ироводят хроматографирование с применением омеси изоиропиловый СИ1-ФТ : аммиак : вода (7:1:2) с таким расчетом, чтобы фронт растворителя достигал края бумаги. После высушивания хро.матограмму дополнительно проявляют (в обц-1ей сложности три раза). Пуклеозид и нуклеотид, находящиеся в нижней части хроматаграммы, регенерируют путем извлечения из бумаги. Олигонуклеотиды, сконцентрированные в верхней ча.сти хроматограммы, элюируют, и элюат (выпаривают методом вымораживания (18%).

Получают следующие .вещества: б-Азауридий-монофосфат 6-Азацитидин-монофосфат, Азауридилилазауридин Азауридилазацитидин Азащитидилилазацитидин

Эти вещества имеют 2,5- и 3,5-ИНтернуклеотидные связи.

Пример 4. 0,3 г 5-гидроксиуридина и I г 1 аП2РО4 2Н20 обрабатывают аналогично примеру 1, но с те.м отличисм, что нуклеотиды Ki изолирОЗанном виде выделяют по методу бумажной хроматографии иа njecni листах хроматографической бумаги. Изолированные нуклеотидные фракции выделяют с 82%-ным выходом. Получают следующие вещества:

ГидрО|Ксиуридилил-()-гидроксиуридин Гидроксиуридил- () -гидроксиуридин Гидроксиуридин-З-фосфат Гидроксиуридин-5-фосфат Гидроксиуридин

Пример 5. 2,44 мг ур,идин-2-14С растворяют в 0,1 мл воды и к полученному раствору добавляют 0,1 м-л .водного раствора, содержащего 3,24 мг нерадиоактивной уридиловой кислоты. После тщательного .перемешивания воду удаляют методом вымораживания. Смееь нагревают при те.мпературе 160 С в течение 5 мин, причем в сосуде для ироведения реакции поддерживают вакуум. Продукт реакции выделяют .в чистом виде по примеру 3. Получают радиоактивный уридилил- (3- -5) -уридин (8%), уридцл.нл-(2-5)-уридин (8%) и 30% уридин-2(3)-фосфат. Пе вошедший .в реакцию исходный 1-С-уридиц регенерируют. Пример б . 360 м.г азацитидина и 1,17 г NaH2PO.- 2П20 обрабатывают, как указано в примере I, ио с тем отличием, что нуклеотиды выделяют по методу бумажной хроматографии ка шести листах хроматографичеакой бу.маги. Выход цуклеотидов 65%. Получают следующие вещества:

Азацитидилцл- (3-5) -азацитидин Азацитидилил-(2-5)-аза.цитидин Азаццтидин-2 (3) -фосфат .цитидин

Пример 7. 350 мг уращилксилозида и 1,2г NaH2PO421 20 обрабатывают, как указано ij примере 1, но с тем отличием, что нуклеотиды (выход 26%) выделяют ио методу бумажной хроматографии на шести листах хроматографической бумаги. Получают урацилксилозид-монофосфат.

Пример 8. 3 мг туберцидина и 16 мг Nan2PO42n2O обрабатывают, как указано в иримере 1, но с тем отличием, что нуклеозиды выделяют по методу бумажной хроматографии иа одном листе хроматографической бу.маги. Выход еуклеотидов 25%. Получают туберцидин-монофосфат.

П р е д е Т изобретения

1. С.иособ иолучения нуклсотидов или олигонуклеотидов на основе природных и аномальных .нуклеозидов, отличающийся те.м, что, с целью упрощения технологии процесса, нук..юозид или смесь нуклеозидов подвергают обработке фосфатом щелочного металла в соотиощрнии 1:1 -10 при температуре 155-165° С 5 смеси и .выделением отдельных иуклеотидов п олигонуклеотндов в чистом }зиде. 2. Споеоб по п. 1, отличающийся тем, что смесь нуклеозидоз и фосфат щелочного металла берут в соотношении 1:5.5 6 3. Способ поп. 1, отличающпыс.ч тем, что в камеегвс аномальных (Клеозидов ирименяют 6-азауридии, 6-азадитидин, б-океиуриднн, урацилкеилозид и тубарцидин.