СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА Советский патент 1974 года по МПК C12P13/08 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известен способ получения L-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и азота ацетатные ионы и необходимые для синтеза питательные соли с последующим выделением L-лизина.

Предлагаемый способ увеличи-вает выход аминокислоты.

Достигается это тем, что из рода Brevibacterium используют штамм flavum АТСС 21129.

При этом концентрацию ионов ацетата в среде поддерживают равной 1,5 вес. %, а рН среды 7,0-8,5.

Для получения L-лизина из культуральной среды по предлагаемому способу в качестве источника углерода используют соли уксусной кислоты, такие как ацетат калия, ацетат натрия, ацетат аммония и ацетат кальция, или уксусную кислоту, а в качестве источника азота - мочевину, аммиак или соли аммиака, такие как хлористый аммоний, сульфат аммония и карбонат аммония.

Ацетат аммония применяют в качестве вещества, которое одновременно служит источником углерода и азота.

Кроме источников углерода и азота добавляют сооответствующее количество минеральных составляющих, витаминов или витаминосодержащих веществ для окончательного формирования среды. В качестве таких веществ используют витамины HI, биотин, дрожжевые экстракты, жидкость после вымачивания зерна, белковый гидролизат из соевых бобов, рыбную муку, вываренную рыбную муку, гидролизат казеина.

Микроорганизмы, которые способны к выделению L-лизина в среде, содержащей ацетатные ионы в качестве источника углерода, щироко распространены. Такие микроорганизмы получают в виде мутантов, имеющих определенные биохимические характерные особенности, которые известны в процессах ферментативного получения L-лизина, использующего карбогидраты в качестве основного источника углерода.

Микроорганизмами, которые могут продуцировать L-лизин, используя ацетатные ионы в качестве основного источника углерода, является например: Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium ammoniagenes, Corynebacterium acetoacidophilum, Micrococcus glutamicus u Arthrobacbtcr atreus. Способ заключается в следующем. На первой стадии микроорганизмы высевают на исходную среду, содержащую вместе с ацетатными ионами в количестве меньше 4% (предпочтительно менее 2%) и проводят аэробное выращивание микробов при перемешивании. Так как прибавленные в начале ацетатные ионы в исходной среде ассимилируются -по мере инкубации, iB среду во время выращивания бактерий непрерывно или -периодически вводят ацетатные ионы вместе с источником азота. Введение ацетатных ионов во время культивации ведут так, чтобы концентрация ацетатных ионов в среде не превышала 1,5%, и чтобы значение рН культивируемой среды было от 7-8,5. Для установления концентрации ацетатных ионов и рН в среде используют раствор из смеси уксусной кислоты и ацетата аммония соответственно 1 : 0,5-0,75, предпочтительно 1 :0,1-0,5. Когда раствор из смеси с указанным молярным соотношением подают в среду, поддерживая в ней значение рН между 7,0-8,5, концентрация ацетатных ионов в среде не превышает 1,5 вес. %. Если содержание ацетата аммония в растворе смеси больше этих значений, концентрация остаточной уксусной кислоты в культуральной среде увеличивается и соответственно продуцирование L-лизина замедляется. И наоборот, когда это содержание меньше, соотношение между углеродом и азотом в среде становится неподходящим для продуцирования L-лизина. В тех случаях, когда источник азота, такой как газообразный аммиак, водный раствор и мочевину подают отдельно, -проверяют рН среды для того, чтобы оно имело значение между 7 и 8,5 и концентрацию ацетатных ионов для получения хорошего выхода L-лизина. Для увеличения выхода L-лизина в культуральную среду вводят карбогидраты вместе с ацетатными ионами в виде их смеси. Обшее количество добавляемых в среду карбогидратов во время ферментации находится в пределах 20% (предпочтительно 5-il5%), исходя из расчета общего количества адетатных ионов, добавляемых в среду. Извлечение L-лизина из питательной среды ведут известными способами, например при помощи ионообменных смол. Пример 1. Brevibacterium flavum АТСС 21129 высевают на культуру (рН 8) следующего состава: Гидролизат крахмала (рас-1,5% считанный по глюкозе) Ацетат аммония0,3% КН2РО40,1% MgSO4-7H2O0,04% Fe++2 ррт Мп++2 ррт Белковый гидролизат из сое-3 ррт вых бобов DL-метионин10 мг/дл Биотин50 у1л. Витамин Bi-HCl200 Y/Л. Инкубацию ведут в течение И час при 31,5°С в аэробных условиях. Основную культуральную среду вводят в стеклянные ферменторы-качалки небольшого размера порциями по 300 мл. Все порции стерилизуют при 110°С в течение 10 мин. Основная культуральная среда (рН 6,5) имеет следующий состав: Ацетат аммония1,2% КН2Р040,2% MgSO4-7H200,04% Fe++2 ррт Мп++2 ррт Белковый гидролизат из сое- 4 мл/дл вых бобов L-треонин15 мг/дл LL-метионин30 мг/дл Биотин50 Y/л Витамин Bi-HCl40 -у/л Мочевина0,2%. 15 мл обсемененного .питательного бульона добавляют к основной культуральной среде в ферменторе и ведут инкубацию при 31,5°С, перемешивая среду со скоростью 1350 об/мин при аэрации в том же объеме в 1 мин, что и для бульона. После 5 час .культивирования значение рН культуральной среды становится равным приблизительно 8,2. Автоматически подают водный раствор, содержащий уксусную кислоту в количестве 40% и газообразный аммиак, сохраняя концентрацию уксусной кислоты в среде ниже 1,5 вес. % и значение рН между 7,5 и 8. Таким образом, в 48 час культуре накапливается 4,34 г/дл L-лизина (эквивалентно 25,2 вес. % относительно всего количества используемой уксусной кислоты). Количество уксусной :кислоты, введенное в среду, составляет 17% по весу от количества исходной среды. Из 390 мл питательного бульона получают 13,7 г неочищенного кристаллического L-лизина. Пример 2. Основную культуральную среду вводят в пять стеклянных ферменторовкачалок небольшого размера порциями по 300 мл соот1ветственно. Все порции стерилизуют при 110°Св течение 10 мин. Обсемененный культуральный бульон в количестве 15 мл, приготовленный тем же способом, что и в примере 1, добавляют в основную культуральную среду в каждом стеклянном ферменторе. Инкубацию ведут при перемешивании (1350 об/мин) в условиях аэрации в том же объеме, что и для бульона. Основная культуральная среда (рН 6,5) имеет следующий состав: Ацетат аммония1,2% Гидролизат крахмала (рас- 1 % считанный по глюкозе) Сульфат аммония0,7% КН2Р040,2% MgS04-7H200,04% Fe++2 ppm Mn++2 ppm Белковый гидролизат из сое- 4 мл/дл вых бобов L-треонин15 мг/дл DL-метионин30 мг/дл Биотин50 Y/л Витамин Bi-HCl40 Y/Л Мочевина0,2%. Когда значение рН среды становится равным .приблизительно 8,2 после 5 час культивации, растворы смесей из уксусной кислоты и ацетат аммония (концентрация уксусной кислоты в растворе 60%), имеющие молярные соотношения, приведенные в табл. 1, вводят в каждый ферментор до тех тор, пока значение рН среды не становится равным приблизительно 7,6. Раствор добавляют автоматически, когда значение рН среды возрастает до 7,7. Добавление смешанного раствора прекраш,ают для 46 час культуры, и далее ведут дополнительную инкубацию в течение 2 час (48 час в обш,ем). Выход L-лизина в каждом ферментируемом бульоне приведен в табл. 1. Таблица 1 DL-метионин30 мг/дл Биотин50 Y/л Витамин Bi-HCl40 Y/Л Мочевина0,2%. Обсемененный культуральный бульон Brevibacterium flavum АТСС 21129 в количестве 15 мл, который готовят так же, как в примере 1, добавляют к основной культуральной среде в ферменторе-качалке. Инкубацию ведут при 31,5°С при скорости перемешивания 1400 об/мин с постоянной степенью аэрации. После 5 час культивирования рН культуральной среды становится равным приблизительно 8,2. Поэтому в каждой ферментер начинают подачу раствора (концентрация уксусной кислоты в растворе 60%), состоящего из смеси растворов уксусной кислоты и ацетата аммония с молярным соотношением 1 : 0,25 и гидролизата крахмала (рассчитанного по глюкозе) возрастающей концентрации (см. табл. 2). Раствор подают в каждый ферментор - качалку до рН 7,5. Подачу раствора повторяют автоматически, если рН среды увеличивается приблизительно до 7,7. Добавление этого раствора прекращают для 58 час культуры и затем ведут дополнительную инкубацию в течение 2 час (в сумме 60 час). Выход L-лизина в каждом ферментируемом бульоне приведен в табл. 2. Таблица 2