Способ получения -лизина Советский патент 1978 года по МПК C12D13/06 

(ствр,ил,изова«1ньгй); биотин 50 .иг/л; тиамин . Н€1 200 (рН 7,0).

Каждьгми 0,1 мл взвеси «летсж засевают 3 мл среды В, содержащей определенное йчоличество а-а1м«нолаур иллад та ма (АЛЛ), у-метиллйзина (МЛ) или N -Kap6o6eH30:Kсил.изина (КБЛ), л микроорганизмы выращивают iB цробирке на 10 мл три 30° С 20 час прИ периодическом взбалтывании.

В npOiUecce вы1ращиваНия рост взвеси определяют измерением оптической плотности .в 562 мм 1бульоиа «ультуры, .разбавленной I : 26. В табл. 1 приведены полученные результаты.

Таблица 1

АТСС 13869 является исходным штаммом для А1 3985, AI 3986, А1 3987. AI 3988, А1 3989 и AI 3990.

А 3989 и А 3990 выращиваются в среде В, содержащей, кроме того, 500 мг/мл Ь-алаппаа к 5 мг/м.1 иикотииамида.

АТСС 15806 является исходным штаммом для AI 3991, AI 3983 к А1 3984.

А1 3445 (АЕС) является мутантом, производящем Ь-1Л|ИЗИ1Н, вида лактофермент Brevibacterium, .который не обладает стойа остью 1ПО Отношению к |КБЛ, МЛ или АЛ

Полученные мутанты м.огут производить большое (Количество L-лизина в среде даже и то,м случае, когда обладают только теми характеристиками .стойкости « АЛЛ, .ИЛ ;: КБЛ, Которые приведены выще; Боди они имеют дополлительную стойкость по отн;;шению к 5-(2-аминоэтил) - L - цистеину (АЕС) ИЛИ (Потреблению аланина, то производствО L-лизииа значительно -возрастает.

В качестве источника углерода могут быть использованы карбогидраты: глюкоза сахароза, меласса или гидролизат крахмала; органические кислоты: уксусная, пропионова1Я или бензойная; спирты; этанол, пропанол; а для некоторых штаммов - углс вадородЬ.

В Качестве Источника азота можно использовать -аммиак, сульфат аммония, нират аммолия, фосфат аммония, мочевину т. д.

в качестве ростовых веществ можно использовать гидролизат сое-вых бобов, лшеничный ,нтр|Ир|Ованны:й .раствор, э«стpaiKT дрожжей «ли яептоя. Выращивание осуществляют в аэробных условиях при 24-37° С в течение 2-7 дней при рН 5-9, поддерживаемам добавлением щелочи, кислоты, карбоната кальция или газооб;разного аМмиа,ка. L-лизи.н отделяют от Сре,ды с помощью иоНОобмениых смол или кристаллизацией. Пример 1. 20 мл среды выращивания культуры, соста,в которой приведен даиже, помещают в колбу емкостью 500 мл, которую 1пер,иодически взбалтывают и нагревают до :110° С 5 мин. Состав среды, г/дл: глюкоза 10; сульфат аммония 5; КН2РО4 0,1; MgSO4 7Н2Ь 0,04; FeSO4-7H20 1,0 мг/дл; MnSO4 4Н2О 1,0 мг/дл; биотин 5,0 мг/дл; тиамин НС1 20,0 жа/фг; гидролязат Соавых -бобов 1,5 мг/дл (о;бщее содержащие азота 7%); карбо.нат кальция (стерилизоваиный) 5% (рН 7,0). Каждый ви|д микроорганизмов, приведенных в табл. 2, прививают .на среду для выращивания культуры я температуру .среды .поддерживают на уровне ЗГС 72 час, при этом лериодичеоки 1ВЗбалтывают. Таблица 2 Количество накопившегося L-лизина, Микроорганизм

2,0 1.5

27

28

37

36

18

После защершбния процесса выращиван.ия определяют общее содержание L-лизи.на в (Получаняом таким образом медиуме (в табл. 2 это количество пр.иведено в виде гидрохлор.ида L-лиз.и.на).

Пример 2. Corynebacterium acetoglutamicum AI 3983, AI 3984, AI 3991 или ATCC 21491 (AEC) выращивают, как в примере 1. В соответствующей среде для выращивания культуры обнаруживают произведенный L-лизин в количестве 25, 24, 3,0 и 15 г/л, соответственно.

.Пример 3. МикрооргакиЗМы, которые Приведены iB табл. 3, выращи1вают аэробно в 50 мл орады, содержащей вытяжку из семян, При 31° С 18 час.

Таблица 3

Количество

накопившегося L-лизииа,

.Микроорганизм г/л

94 41

Таблица 4

35

Порции объемом 300 мл той же среды, которую используют в примере 3, с концентрацией глюкозы 1 г/дл и добавлением 1 г/дл этилового спирта вместо 0.5 г:дл ацетата аммония, помещают в сосуд для ферментации, объемом 1 л и сосуд нагревают. Среду для вьгращи.вания культуры помещают в бульон семенной культуры объемом 15 мл, состав которой приведен выше. Выращивание осуществляют аэробно при 31° С.

В процессе выращпваиия .рН среды поддерживают 7,2-8,2 при помощи газообразного аммония. Концентрацию спирта в среде для выращивания культуры периодически контролируют при помощи газовой хроматографгШ. Пх ддерживая на уровне 0,3 г/дл полплткой этиловым спиртом.

Предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с известным повышенный выход L-л.изина. Состав среды, содержащей вытяжКу из се.мян. eid.i: глюкоза 1,5; ацетат аммония 0,3 мочев 1на 0,1; Ms:SO4 7Н9О 0,4; 1 Н2РО4 0,01; MnSO4.4H2O 1 мг/дл; FeSO4 7Н2О 1 мг/дл; биотин 50 лгг.л; тиамин НС 200 гидролизат соевых бобов 3 мл/дл (общее содержание азота 7% рН 7,5). Триста частей среды для выращиванил культуры, состав которой приведен .выше, но.мещают в сосуд для ферментации объемом I л, нагревают, а затем в сосуд вносят 15 мл бульона среды состава, глюкоза 2; ацетат аммония 0,5; .мочевина 0,2; {XH4)9SO4 0.5: 1 Н2Р04 0,1; MgSO4 7Н.,О 0,04; FeSO4 7Н2О 1 мг/дл; MnS04 4Н2О 1мг:дл; биотин 50,иг/л; тиамин 60 мг/л: гидролизат соевых бобоз 3 мг/дл (рН 7,5). Выращивание осуществляют аэробно при 30° С. В процессе выращива.н.пя добавляют ВОДНЫЙ раствор, содержащий уксусную кислоту и ацетат аммония, для ноддержания рН среды на уровне 7,2-8.0. Спустя 72 час в пгооцессе выращивания в образова.Бщейоя таким образом среде накапливается L-лизин, общее количество которого приведено в табл. 3. Пример 4. Микроорганизмы, приведенные в табл. 4, выращивают аэробно при 31° С IB течение 18 час в 50 мл среды для выраЩивания культуры согласно ир.имеру 3 с добавлением 0,5 г/дл этилового спи.рта и 0,3 г/дл мэчевл.нь вместо 0,3 г/дл ацетата аммония и 0,1 г/дл мочевины.

Выращивание осуществляют 56 час. В табл. 4 лриведены количества Ь-лизн«а, Котарые были .найдены в соответствующих среда1..

Пример 5. Приготавл-ивают среду для (Выращивания «ультуры, состав .которой приведен .ниже, и 20 мл среды иомешают в катбы объемом 500 мл, рреду нагревают, лер.иод.ически взбалтывая.

Л пкрооргаиизм

Приготавливают 1 л бульона, засеянного микроорганизмами вида AI 3989,1ка,к описано выще, затем засеянный бульои помещают в центрифугу для извлечения клеток; всплывающую часть .среды обрабатывают кислой ионообменной смолой «Amberlite lR-12Q--. Абсорбированный «а смоле L-лизин вымывают 3%-ной аммиачдой .во. до и, а из элюата извлекают кристаллы двугидрата гидрохлорида Ь-лизииа (28,5 г).

Ф О р .м .у л а и 3 о б р е т е -н и я

Среду засевают .микроорганизмами, которые ириввдены в табл. 5, и выдерживают при 30° С 72 час, периодически взбалтывая.

Полученная среда содержит L-лизин в количествах, Котарые .приведены в табл. 5.

Таблица 5

Количество накопившегося L-лизина, г/л

меласса свеклы , меласса тростника

19 27 29 37 18 23 25

щийся тем, что, с целью повыщения выхода, в качестве микроорганизмов, продуцирующих L-лизии, используют щтаммы Brevibacterium lactofermentum FERMР 3382, FERM-P 3383, FERM-P 3384, FERM-P3386, FERM-P 3387 или Corynebacterium acetoglutamicum FERM-P 3380, FERM-P 3381 или FERM-P 3414, устойчивые no отнощанию к а-аминолауриллактаму, 7Мбти.ллизи.ну или N -жарбобензоксилизину.

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

СССР

1. Авторское свидетельство №,378411, кл. С 12 D 1.3/06, 1971.