СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Советский патент 1971 года по МПК C12N1/26 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к получению биологически активных веществ.

Известен способ получения биологически активных веществ путем выращивания их продуцентов Brevibacterium ketoglutamicum в питательной среде, содержащей углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли в присутствии стимуляторов роста, например биотина.

Для большей эффективности и экономичности получения биологически активных веществ по предложенному способу в качестве продуцента используют Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587.

Предложенный способ осуществляется следующим образом.

Выращивание продуцентов Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587 для получения биологически активных веществ производят в питательной среде, содержащей углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли в присутствии стимуляторов роста, например биотина.

Процесс может протекать как в синтетической питательной среде, так и в естественной ферментативной среде, в течение всего периода времени, пока питательная среда содержит основные, необходимые для нормального роста и развития щтамма микроорганизма питательныр вещества, которые подаются в питательную среду в соответствующих количествах.

В качестве основного источника углерода в ходе протекания процесса используют газообразные углеводороды, в частности такие, как метан, этан, пропан, нормальный бутан, изобутан, пропилен, бутилен и тому подобные соединения, а также различные смеси указанных соединений.

В ходе проведения процесса в ферментационной среде в незначительных количествах могут, кроме того, присутствовать другие источники углерода, например жидкие углеводороды, включающие в себя парафины: нормальный пентан, нормальный октан, нормальный декан и углеводы (глюкоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, крахмал, крахмальные гидролизаты, меласса и т. п.) или другие соответствующие источники углерода (глицерин, маннит, сорбит, органические кислоты, глютамииовая кислота и т. п.).

Эти соединения могут использоваться как в чистом виде, так и в виде двух или более упомянутых соединений, при этом количество этих веществ незначительно по сравнению с количеством газообразных углеводородов.

В качестве источника азота применяют различного типа неорганические либо органические соли или соединения, такие как мочевина, аммиак, аммонийные соли (хлористый аммоНИИ, сернокислый аммоний, азотнокислый аммоний, фосфат аммония и т. п.), или одну или несколько аминокислот в комбинации с натуральными соединениями, содержащими азот, кукурузный, дрожжевой, мясной экстракты, пеитон, рыбную муку, казаминокислоту, рыбные растворимые иродукты, экстракт рисовых отрубей, рибонуклеиновую кислоту и т. п. Зти соединения можно употреблять как в чистом виде, так и в виде различных сочетаний. В качестве неорганических соединений применяют сульфат магния, фосфат натрия, нервичный кислый фосфорнокислый калий, вторичный фосфорнокислый калий, сульфат железа или другие соли железа, хлористый магний, хлористый кальций и т. п. Для ускорения роста могут быть введены биотин или аминокислоты (глютаминозая или аспарагиновая). Ферментацню нроводят в аэробных условиях, в частности нри аэробном встряхивании культуры или при перемешивании погруженной в питательную среду культуры, при температуре в пределах 20-50°С и рН среды 4,0-9,0. Получаемые по предлагаемому способу аминокислоты включают такие соединения, как глютаминовая кнслота, валин, лизин и аланин, а получаемые сахариды включают такие соединення, как глюкоза, трегалоза. Кроме того, могут быть получены также витамины - рибофлавнн (витамин Е), органические кислоты (лимонная кислота, аденозин5-фосфат. дифосфат аденозина и трифосфат аденозина). Для получения аминокислот н относящихся к классу кислот циклических соединений в ферментативную среду следует вводить значительные колнчества источника азота, и кроме того, различные антибиотики, поверхностно активные вещества, жирные кислоты, спирты. Изобретение иллюстрируется следуюодими примерами. Пример 1. В трехгорлой колбе емкостью 250 мл приготовляют 20 мл питательной ферментативной среды сле.1,ующего состава: NH4N082% Ь;а2НРО4-12Н2О0,05% КНоРО..0,05% MgSd4-7H200.01% MnS04-H2O0,001% FeS04-7H2O0,001% MnSO4-7H2O0,001% CaCl2-2H2O0,001% CuSO4-51-12050Y/1 НзВОзlOv/l Na2MoO.r2H2OIQy/l Экстракт кукурузный0,1% Значение рИ питательной АТСС 15587 в условиях аэробного встряхивания инокулируется в ферментативной среде, после чего эту среду встряхивают при температуре 30°С с помощью термостатического смесителя. Затем в среду вводят газовую смесь нормального бутана с воздухом, при этом концентрация бутаиа в ней составляет нредпочтительно 50% по объему. Неиспользованный бутан может быть направлен на рециркуляцию и совместно с порциями свежего бутана вводиться в ферментативную среду. По истечеиии трех дней культивирования в среду вводят 0,1% бромида цетилтриметиламмония, иосле чего проводят дальнейщее культивирование в теченне четырех дней. В результате чего в ферментативной среде образуется 0,30 г/дцл левовращающей глютаминовой кислоты, 0,12 г/дцл аланина, 0,05 г/дил валина и 0,00 г/дцл лизина. Культивирование осуществляют в пятидесяти трегорлых колбах емкостью 250 мл и полученный G результате культивировання сироп сливают из всех колб с последующ.им отделе щем от клеточного материала микроорганизмов (что производят путем центрифугирования) и получают полностью сброженный сироп. Затем рП среды 1 л полученного сиропа доводят до «2,0 путем добавления соляной кислоты, обрабатывают в колонке с ионообменной смолой катионного тииа Амберлит УК 120 (тина Н), после чего ироизводят выделение индивидуальных аминокислот методом элюирования посредством последовательного повышения значений рН. После этого концентрируют сироп и получают 0,8 г аланина. 0,4 г валина и 5 мл лизина. Кро.ме того, выделяют 4 г сухого клеточного материала микроорганизмов. Пример 2. В ферментативной среде, которая используется в ходе проведения процесса, описанного в примере 1, осуществляют инокулирование Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587, после чего в условиях, описанных в примере 1, производится культивирование. По истечении суточного процесса культивирования в ферментативную среду вводят 50 ед/мл пенициллина G, и культивирование продолжают в течение 6 час. По завершении процесса культивирования выделяют 0,45 г/дцл левовращающей глютаминовой кислоты, 0,1 г/дцл трегалозы и 0,001 г/дцл глюкозы. Полученную L-глутаминовую кислоту подвергают адсорбции в колонне с ионообменной смолой, заиолненной Амберлитом 1R-120 (Н-тииа) так же, как в примере 1, с целью ее выделения. Затем 1 л вытекающей жидкости пропускают через другую колонну с ионообменной смолой, заполненную диалоном SA-1B (тииа борной кислоты), и колонну со смолой элюируют 0,005- 0,03 мол. раствором борной кислоты для фракционирования трегалозы и глюкозы, нри это.м получают 0.8 г кристаллов трегалозы и 5 мг кристаллов глюкозы.

Пример 3. Производят инокулирование Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587 в ферментативной среде, состав которой аналогичен составу ферментативной среды, используемой в ходе проведения процесса по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что концентрация азотнокислого аммония в данном случае доводится до 0,2%, а концентрация экстракта кукурузы доводится до 0,01%После этого ферментативная среда подвергается встряхиванию в течение 7 дней в условиях, в которых проводится аналогичная операция в ходе осуществления процесса, описанного в примере 1. По завершении указанного процесса в ферментативной среде образуется 0, а-кетоглутаровой кислоты и 0,001 г/дцл лимонной кислоты. 1 л натуральной жидкости пропускают через колонну со смолой, заполненную Диалионом SA-11 RA (ОН-типа), что приводит к образованию лимонной кислоты и сс-кетоглутаровой кислоты, которые адсорбируются на указанной смоле, а затем колонну со смолой элоируют водой или водным раствором аммиака (до 1 н раствора), что нриводит к фракционированию смеси на лимонную кислоту и сс-кетоглутаровую кислоту.

К раствору элюата добавляют примерно 1 г СаСЬ для отделения кальциевых солей, соответственно, лимонной и а-кетоглутаровой кислоты, при этом получают 5 мг цитрата кальция и 2 г а-кетоглутарата кальция.

Пример 4. Процесс ферментации осуществляют в условиях, идентичных условиям, описанным в примере 2, в результате чего в ферментативном сиропе образуется 5 мл рибофлавина (витамин 82). К 1 -л культуральной жидкости добавляют 4 н раствора НС1 до рН 1,0 и образующуюся муть удаляют с помощью центрифуги. Фильтрат концентрируют до примерно 100 мл и рП концентрированного фильтрата доводят до нужной величины добавлением едкого натра. Затем раствор выдерживают в течение пяти дней в холодном месте, при этом получают 4,5 мг кристаллов рибофлавина.

Характеристика щтамма Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587.

Морфология:

палочки размером 0,7-0,9X0.8-3,0 мк, встречаются удлиненные клетки, спор не образуют, неподвижны, грам-положительпые.

Культурные признаки:

а) колонии на питательном агаре: пятнистые, гладкие, сплошные, непрозрачные, блестящие; б) на скощенном агаре; умеренный рост, нитевидный, блестящий, розовато-оранжевого цвета, маслянистый; в) на жидкой питательной среде: немного .мутный, с пленчатой поверхностью, образует плотный осадок.

Физиологические характеристики:

растет при температуре 25-37°С (оптимальная 37°С); оптимальная величина рН 6,0-8,0; Аэробные или анаэробные.

Отношение к различным веществам:

Лакмусовое молоко - не измеияет, или имеет И1,елочну1о реакцию: .келатии-не сжнжает; стероводород-не образует; нндол-не образует; крахмал-не гидролизует; каталаза-положительно; уреаза-положительно; щтамм хорощо растет па Н. парафинах в качестве единственного источника углерода и образует кетоглутаровую кислоту, глутаминовую кислоту и аланин; в весьма малых количествах из глюкозы, фрукто.зы и сахарозы образует кислоты, мальтозу не усваивает.

Предмет изобретения

Способ получения биологически активных веществ путем выращивания их продуцентов Brevibacterium ketoglutamicum в питательной среде, содержащей углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические солн в присутствии стимуляторов роста, например биотина, отличающийся тем, что в качестве продуцента биологически активных веществ используют Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587.