СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ Советский патент 1971 года по МПК C12N9/44 

Изобретение относится к ферментной промышленности и касается способа получения амилолитических ферментных препаратов.

Известен способ получения амилолитических ферментных препаратов культивированием бактерий Pseudomonas saccharophila, продуцируюпдих фермент, расщепляющий а-1,4-глюкозидную связь в крахмале.

В соответствии с настоящим изобретением предложен способ получения препаратов изоамилазы, расщепляющей (х-1,6-глюкозидные связи в крахмале.

Способ характеризуется использованием нового штамма бактерий Pseudomonas amyloderamosa 55-15, выделенного из природы.

Ниже приведена биологическая характеристика штамма.

Морфология. Размер клеток 0,4-0,6Х ХЬ2-4,5 мк. Палочки, споры отсутствуют, жгутики полярные, одиночные. Грамотрицательный.

Органические среды. Штрих на агар-агаре (с бульоном при 30°С): гладкая блестящая поверхность, клетки слегка желтоватые. Чашка с агаровой средой (с бульоном при 30°С); колония круглая, сплошная, гладкая и блестящая поверхность, слегка приподнятая, слегка желтоватая, непрозрачная.

Столбик желатины (с бульоном при 30°С):

медленно разжижается в форме воронки.

Культуральная жидкость (с бульоном при

Зб°С): становится мутной, слабый осадок, на

поверхности образуется очень тонкая иленка.

Картофельная среда: колония бурая, блестящая и влажная.

Физиологические и биохимические признаки.

Лакмусовое молоко: становится щелочным. Производство пигмента: водорастворимый пигмент не образуется, клетки становятся желтоватыми.

Пооизводство аммиака: образуется.

Сероводород: не образуется. Индол: не образуется. Нитрат: не восстанавливается. Производство ацетилметилкарбинола: не образуется.

Каталазная активность: положительная. Использование Сахаров и получение из них кислот: в аэробных условиях из глюкозы, арабинозы. маннозы и мальтозы образуется кислота, газа не образуется: фруктоза, галактоза,

лактоза, целлобиоза, сахароза, трегалоза, салипин, а-метилглюкозид, декстрин и крахмал используются в аэробных условиях как источники углерода, кислота не образуется, ксилоза, рамноза, целлюлоза, декстрин и ину3 .

Сорбит, маннит, инозит, глицерин не используются.

Бензойная, п-оксибензойная, салициловая кислоты и другие ароматические соединения не используются.

Соли аммония и нитраты как единственные источники азота не используются, требуются органические источники азота, такие как глутаминовая, аснарагиповая кислоты или белковый гидролизат.

Оптимальная темнература роста; 25-30°С. Не молсет расти при 37°С.

Оптимальный рН роста: 6,5-7,5. Летальная температура: 70°С в течение 10 мин.

Потребность в кислороде: аэробный.

Способ получения амилолитических ферментных препаратов согласно настоящему изобретению заключается в культивировании штамма Pseudomonas amyloderamosa SB-15 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота в присутствии необходимых для роста минеральных солей.

В качестве источников углерода применяют крахмал, растворимый крахмал, декстрин, кислый гидролизат крахмала, ферментативный гидролизат крахмала, мальтозу и другие материалы, имеющие а-1,4- или а-1,6-глюкозидные связи.

В качестве источника азота используют соли аммония, нитраты и мочевину вместе с глутаминовой, аспарагиновой кислотами или другими органическими азотсодержащими соединениями, например пептоном, кукурузным экстрактом, дрожжевым экстрактом, белковым гидролизатом и т. п. Органические вещества могут использоваться без минеральных.

Широко используется натуральная среда, состоящая из порощков риса и сладкого картофеля, в которой существует хорошее соотношение источников углерода и азота.

Температуру культивирования поддерл ивают в интервале 20-30°С, рН 6-8. Для получения высокого выхода изоамилазы рН поддерживают в кислой области.

После завершения культивирования клетки отделяют центрифугированием. Жидкость может использоваться в качестве неочищенного ферментного раствора. Для получения препаратов изоамилазы проводят осаждение с помощью растворителя, высаливание, адсорбцию, сгущение раствора и т. и.

Фермент устойчив при рН 3-6. Изоамилаза, полученная в соответствии с настоящим изобретением, может использоваться для получения амилазы из крахмала и других целей.

Пример 1. Среду состава, %: мальтоза 2,0; глутамат натрия 0,2; ( 0,3; КНзРОл 0,1; MgSO4-71-120 0,05; остальное вода; рЫ 7,0, засевают культурой Pseudomonas amyioderaraosa SB-15 и процесс ведут при

встряхивании нри 30°С в течение 120 час. Культуральную лсидкость, имеющую изоамилазную активность 180-220 ед/мл, центрифугируют при скорости 10000 об/мин в течение 10 мин. Клетки отбрасывают. Жидкость охлаждают, перемешивают, добавляют 75%-ный ацетон. Осадок фермента отделяют, лиофилизуют и получают изоамилазу в виде порошка. Выделение обеспечивает выход 80-90%. Препарат устойчив, если хранится в сухом виде.

Он может быть очищеи обработкой сульфатом аммония или другим методом.

Пример 2. Среду, имеющую состав, %: растворимый крахмал 1,0; (Nn.i)2HP04 0,3; labPOi 0,1; полипептон 0,1; MgSO4-7H2o 0,05;

остальное вода; рП 7,0, инокулируют тем же микроорганизмом, что в примере 1. Процесс ведут при 30°С в течение 72 час. Получают выход изомилазы 82%.

Предмет изобретения

Способ получения амилолитических ферментных препаратов путем выращивания их

продуцентов, например Pseudomonas, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, в присутствии необходимых для роста минеральных солей, отличающийся тем, что, с целью получения изоамилазы, гидролизующей только связанный с крахмалом ос-1,6глюкозид, в качестве продуцента используют Pseudomonas amyloderamosa SB-15.