СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ИНАКТИВАТОРОВ Советский патент 1969 года по МПК C12N9/48 

Способ выделения ферментных инактиваторов, например калликреина, из комплекса энзима, присоединенного к полимерному носителю, не известен.

Для получения высокоочищенного инактиватора предлагается комплекс энзима и полимерного носителя нр.иводить в воде в контакт с раствором калликреин-инактиватора. После этого полученный комплекс промывают, диссоциируют и изолируют таким образом инактиватор.

Способ выделения ферментных инактиваторов, нанр.имер каллнкреияа, заключается в том, что энзимы, например трипсин, химотрипсин, калликреин, присоединяют ковалентно к нерастворимому или растворимому носителю (полимерному веществу). Полученный при этом продукт присоединения приводят в воде в контакт с раствором калликреин-инактиватора, полученный при этом комплекс очищают промыванием, например, водой и буферным раствором диссоциируют и выделяют калликреин-инактиватор.

Причем носители (полимерные вещества) ДОЛЖНЫ содержать функциональные группы, способные реагировать с энз имами по методу химии пептидов, .например смолы, содержащие группы ангидрида хлорангидрида кислоты, изоцианата и азида или смолы, содержащие активированные атомы фтора.

Диссоциация достигается, например, посредством смещения рН или добавлением веществ, ослабляющих действие молекулярного обмена, напрршер, мочевины.

Пример. Для получения калликреин-колонки 400 мг калликреина гомогенизируют в 200 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 7,5 при 0°С. Затем добавляют 2 мл 1%-ного раствора

гексаметилендиамипа, размешивают в течение 3 мин, после чего добавляют 100.000 КЕ (2упротеин КЕ), растворенные в 20 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 7,5. Полученную суспензию размешивают около 8 час при температуре О-4°С. Для выделения калликреина 80000 единиц калликреина смещивают приблизительно с четырехкратным объемом иорощка целлюлозы и залнвают в колонку (вышеописанную), охлажденную водой и заполненную

Sephadex G-25 слоем в 1 см. Последнюю промывают буфером с рП 7,8, содержащим 0,1 М триэтаноламина и 0,2 М NaCl, адсорбнруют в колонке 75000 единиц, из них 40000 единиц элюируют аммонийацетатным буфером с

рП 2,0.

Калликреин-.инактиватор можно элюировать от калликреин-колонки 8 М раствором моче-, вины с добавлением буфера с рН 7,8 0,1 М триэтаноламина при нейтральном рН. Посли 3 Sephadex G-25 выход фермента каллекреининактиватора составлял около 100%. „. I I П Р Л ЛЛ PTlf OOTlPTPHM i 1 Р с д м с 1 11J и и р с 1 с л ,и и Способ выделения ферментных инактивато-5 ров, например калликреина, .из комплекса энзима, присоединенного к полимерному носите-4лю, отличающийся тем, что, -с целью получения высокоочищенного инактиватора, комплекс энзима и иолимерного носителя приво ц . ц контакт С рнствором калликреининактиватора, после чего полученный комплекс промывают, диссоц-иируют и иаолируют таким образом инактиватор.