Способ получения фосфорибулокиназы Советский патент 1985 года по МПК C12N9/00 

сд

4

САЭ

to

;о Изобретение относится к производству ферментов, а именно к технологии их получения и может быть использовано для получения ценного реагента - рибулозо-1,5-дифосфата и при создании искусственной сиетемы для моделирования работы карбоксилирующей фазы фотосинтеза. Известен способ получения фосфорибулокиназы из листьев шпината. Способ предусматривает гомогенизацию 8 кг листьев шпината, двукратное насыщение полученного сока сульфатом аммония (17-40/о), двукратное осаждение охлаждаемым ацетоном (40-50%), снижением рН среды до 4,5, двукратным осаждением сульфатом аммония (35-55%) и вновь дробным осаждением сульфатом аммония (25-45%) 1. Однако этот способ предполагает использование значительного кoличecfвa исходного материала (листьев шпината), больших объе мов гомогената (до 5л) и многократное фрикционирование сульфатом аммония, что приводит к значительным потерям фермента в процессе очистки. Известен также способ получения фосфорибулокиназы из листьев шпината путем их гомогенизации, насыщения сульфатом аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Способ включает экстракцию листьев шпината в трыс-НС1 буфере рН 8,1, двукратное насыщение сульфатом аммония (30-60%), экстрагирование ацетоном, охлажденным до -20°С (30-50%), новое насыщение сульфатом аммония, до 55%, гель-фильтрацию через сефадекс G- 200, насыщение сульфатом аммония до 75%, гель-фильтрацию через сефадекс G-25, ионообменную хроматографию через диэтиламиноэтилцеллюлозу 2. Известные способы сложны и обеспечивают недостаточно высокий выход целевого продукта. Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что при способе получения фосфорибулокиназы путем гомогенизации листьев растений, насыщения сульфатом аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии используют листья русских бобов, а ионообменную хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе проводят дважды. Пример. 400 г свежесобранных листьев двухнедельных растений русских бобов промывают холодной водопроводной водой и спо ласкивают дистиллированной водой. Остатки воды удаляют с листьев фильтровальной бумагой. Затем в холодной комнате при 4°С листья измельчают в размельчителе тканей РТ-1 в присутствии 400 мл трыс-НС буфера 0,05 М рН 8,0. Полученную суспензию фильтруют через четыре слоя марли. Этот гомогенат центрифугируют при 10000 g., t 0°С на центрифуге V АС-25. Супернатант насыщают сульфатом аммония до 30% и центрифугируют при тех же условиях. Оса док отбрасывают, а супернатант насыщают сульфатом аммония до 60% и вновь центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в минимальном объеме (10 мл) того же буфера. Этот раствор наносят на колонку с сефадексом G-50. Размер колонки 2x30 см. Белок с колонки элюируют тем же буфером. Собранный обессоленный белок наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (2,5X14 см). Затем через эту колонку пропускают 300 мл 0,05 М трыс-НС1 буфера рН 8,0 с градиентом КС1 0,02-0,2 М. Фракции, обладающие активностью фосфорибулокиназы, насыщают до 75% сульфатом аммония, затем центрифугируют. Осадок растворяют в минимальном объеме (5 мл) того же буфера и наносят на колонку с сефадексом G-25 (2 X 30 см). Собранный обессоленный белок наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (2,5 X 14 см) и проводят ионообменную хроматографию, как описано, используя трис- С буфер 0,05 М рН 8,0 и градиент концентраций КС1 0,02- 0,2 М. В таблице приводятся характеристики ферментов, выделенных по предлагаемому и известному способам. Полученный препарат характеризуется однородностью при электрофорезе в 5, 7,5 и 10%-ных полиакриламидных гелях, имеет характерную молекулярную массу в 250 000 дальтон. Предлагаемый способ позволяет повых;ить выход, фосфорибулокиназы и сократить количество стадий выделения.

Удельная активность фермента в листьях, нкат/мг общего белка

Количество очищенного фермента на 1 г листьев, мг

Количество очищенного фермента на 1 г общего белка экстракта

Электрофоретическая однородность

Удельная активность, нкат/мг,белка

Количество растительного материала для получения 1 мг очищенного фермента,

0,24

0,075

0,0071

58

14

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОРИБУЛОКИНАЗЫ путем гомогенизации листьев растений, насыщения сульфатом аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, используют листья русских бобов, а ионообменную хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе проводят дважды.