Г. И. КОКОЕГМЛР.НЛН Лаборатория биохимм!! расгеиий АИ FpysiitiCKofi ССР Советский патент 1974 года по МПК C12N9/28 

Изобретение относится к ферментной нромышленносП.

Известен способ иолучепия а-амилазы путем глубинного культивирования их продуцентов, например Aspergillus oryzae, па питательной среде, содержащей крахмал, азотнокислый Натрий, однозамещеипый фосфорнокислый калИ11, сернокислое железо, сернокислый магний, экстракт из солодовых pocTi;oB, выделення ферментов нз культуральной жидкости на Ионообменных колонках с последующим элюированием нх.

Известный способ дает низкий выход аамилазы. составляющей 25-30%; гетерогенность KOiieiHoro npenapaia, содержащего кроме tt-амилазы качественно другой белок, в Частности фермент декстрнназу; потерю нативпого состояния очниил1ного фермента аамилазы, выражаюи1,уюся в низкой удельной активиости, составляюп1ей 20 ед/мг белка; больщое число операций и их трудоемкость.

С целью получения гомогенной а-амнлазы с больиюй удельной активностью, в пит::гельную среду дополнительно вводят однозамещен11ый фосфорнокислый и азотнокислый магНИИ, а элюнрование осун1ествляют фосфатпым буфером.

Крахмал, азотнокислый натрий, сернокислый магний, сернок1 слое железо вводят в нитательпую среду в колнчества.ч, соответственно равных ЙО; 12; 1,0; (J,0:i г/л.

С целью упрощения способа выделения и очпстки сс-амнлазы, ее элюнрован11е с ионообх1енника производят 0,1-0,4 Л1 фосфатны.1 буферным раствором с рН 6,8-7,4, содержащим Г),001-0,00003 М СаО.

. Культуру му а}ггного штамма Aspergi lu-s огхгао 3 - 9-15 г,1,-1))Гииив;иот 1лубншнлм методом в колбах на ка-ш.чке 72 чаС на нн1ате.1Ы10й среле слел ющего состава, г/л:

Крахмал

80 К Нор О,

0,1 Mg(NO,), 0,8 МаХО, 12 0,5 КС1

Мо-(ИоРОО 0,7 MgSO,i 1 FeSO.,

0,03

Kyvii-.iypy гриба выраннваьэт нрн . фильтрате 72-часовой кулыуры удельная акiHBHocTb а-амилаз1-.1 8-9 ед/мг белка и 20 ед/мл фнл1,1рата. Оби1,ап активность филь1рата 10000 од.

наносят на колонку с 10 г ДЭАЭ целлюлозы, фракцию белков, не содержащую а-амилазу, вымывают 0,05 М фосфатным буфером рН 7,15. Эта фракция содержит G80 мг белка.

0,1 М фосфатным буфером рН 7,15 полностью вымывается фракция, содержащая только сс-амилазу; сс-амилазы составляет 300 мг, а общая активность 10000 ед., т. е. 100% от количества фермента в диализате. Удельная активность сс-амилазы 35 ед/мг белка. Диализ и хроматографию белка на ДЭу Эцеллюлозс провод5гг ири температуре не выше . Аналогичную картину получают и в случае других указанных вьппе штам.мов, которые также могут быть рекЪмендованы для промыщленного получения сх-амнлазы.

Предмет изобретения

1. Способ получения а-амилазы путем глубинного культивирования их продуцентов, папример Aspergillus oryzae, на ннтательной среде, содержащей крахмал, азотнокислый натри11, одпозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислое железо, сернокислый магний, экстракт из солодовых ростков, выделения ферментов из культуральной жидкости на ионообменных колонках с последующим элюировапием их, отличающийся тем, что, с целью

получения гомогенной а-амилазы с больщой удельной активностью, в питательную среду дополнительно вводят одпозамещенный фосфорнокислый и азотнокислый магний, а элюирование осуществляют фосфатным буфером.

2. Способ по п. 1, отличающийся те.м, что однозамещенный фосфорнокислый и азогнокпслый магний вводят в количестве, соответственно равном 0,7 и 0,8 г/л.

3.Снособ но н.п. 1 и 2, отличающийся тем, что крахмал, азотнокислый натрий, сернокислый магний, сернокислое железо вводят в питательную среду в количествах, соответственно равных 80, 12, 1,0, 0,03 г/л.

4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа выделения

и очистки а-амилазы, ее элюирование с ионообменника производят 0,1-0,4 М фосфатным буферным раствором с рН 6,8-7,4, содержащим 0,001-0,00003 М СаСЬ.