Способ стабилизации глюкоамилазы,продуцируемой @ @ в процессе хранения Советский патент 1984 года по МПК C12N9/34 

1 Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и может использоваться для хранения микроорганизмов в музеях коллекционных культур и лабораториях. В настоящее время для хранения микроорганизмов - продуцентов испол зуется целый ряд приемов, например периодические пересевы микробных культур на свежие питательные среды хранение микроорганизмов в сухих стерильных почвах, песке, каолине и солевых растворах l . Однако при этих методах хранения падает ферментативная активност микроорганизмов и необходимо проведение множества пассажей для получе ния первоначальной активности. Известны также способы стабилизации активности микроорганизмов в процессе хранения, предусматривающи выращивание их, высушивание путем модификации и расфасовку 2j . Однако моддификадия имеет ряд не достатков, связанных прежде всего с трудоемкостью процесса и использова нием дорогостоящего вакуумного оборудования и приемника для хранения больших коллекций микробных культур в крупных лабораториях, располагающих специальньм оборудованием. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ стабилизации ферментативно активности Aspergillus awamori в процессе их хранения, предусматривающий выращивание культуры на агаризованной питательной среде, содер жащей крахмал и необходимые минерал ные соли с последующим перес;евом ко нидий на хранение в пробирки на питательную среду аналогичного состава 3. Однако при этом способе наблюдается потеря активности ферментов в процессе хранения культуры. Цель изобретения - повышение глю коам.илазной активности и стабильности ее в процессе хранения. Цель достигается тем, что соглас но способу стабилизации глюкоа1 1Илазы, продуцируемой Aspergillus cTwamori, в процессе хранения, предусматривающему выращивание культуры на агаризованной питательной среде,содержащей крахмал и необходимые минеральные соли с последующи 42 Пересевом конидий в пробирки на питательную среду аналогичного состава, перед пересевом конидий на .хранение осуществляют активацию культуры путем повторного выращивания ее на концентрированной агаризованной питательной среде, содержащей водные вытяжки из солодовых ростков . и отрубей в соотношении 1:1. Используют 5%-ную водную вытяжку из солодовых ростков и 10%-ную вытяжку из пшеничных отрубей. Сущность способа заключается в ел едутрщем. Микроорганизмы вида Aspergillus awamori выращивают вначале на питательной среде, содержащей агар-агар, крахмал, хлористый калий (КС1), сернокислый магний MgSO;), однозамещенный фосфорнокислый калий (), азотнокислый натрий (NaNOo), сернокислое железо (FeSO) при 22-24 С в течение 12-14 сут. Затем осуществляют активацию путем переноса конидий в чащки Петри на концентрированную питательную среду, содержащую водную вытяжку и5 солодовых ростков и отрубей . в соотношении 1:1 в присутствии 2% агара в течение 12-14 сут до достижения зрелости конидий с периодическим отбором колоний по активности. Для проверки активности культуру Aspergillus awamori вьфащивают глубинным методом на питательной среде следующего состава: солодовые ростки, крахмал, NaN04, КС1, MgSO, КН2Р04, FeSO. в течение 2-3 сут при 30-35°С. После вьфащивания глубинным методом наиболее активный вариант пересевался для хранения на питательную среду: агар-агар, крахмал, NaNO, MgS04 , KCl, KHjP04, FeS04. Пример 1. Выращивают в пробирках штамм A per0i11u aviamori 466 на агаризованной питательной среде, содержащей следующие компоненты,вес .%: Крахмал2 RC10,05 MgS040,05 КН 2Р04,0,1 Вьфащивание осуществляют в течение 12 сут при и рН 4,7. Получают культуру с активностью ЯОоп./мл.

3Для активации штамма готовят среду .следующего состава: водная вытяжка из солодовых ростков с массовой концентрацией 5% - 50 мл; водная вытяжка из пшеничных отрубей с массовой концентрацией 10% - 50 мл; 2% агар-агара.

10%-ная водная вытяжка из пшеничных отрубей готовится следующим образом. Навеска отрубей заливается определенным количеством воды (10 г отрубей на 100 мл воды), помещается на кипящую водную баню и выдерживается в течение 1 ч, после чего фильтруется.

Таким же путем готовится водная 5%-ная вытяжка из солодовых ростков (5 г солодовых ростков на 100 мл дистиллированной воды). Экстракции проводят при 30 в течение 1 ч. Полученные вытяжки смешиваются 1:1. Затем к смеси добавляют агар-агар и стерилизуют 30 мин при 0,5 bffla, РН 4,7.

Приготовленную среду разливают по 15-20 мл в стерильные чашки Петри и на поверхность застывшей агаризованной среды пипеткой наносят 1 мл конидиальной взвеси.

Приготовление суспензии конидий проводится следующим способом. Пробирки с 12-суточной культурой, выращенной на агаризованной среде с крахмалом, заливают 10 мл стерильной дистиллированной воды, при помощи петли снимают конидии с поверхности затем готовят разведение 10-

Приготовленную суспензию культуры наносят на поверхность застывшей агаризованной концентрированной среды таким обоазом, чтобы после выращивания в термостате при 22 С в течение 12 сут на поверхности выросло не более 3-7 колоний.

После 12 ч роста проверяют активность активированной культуры. Для этого 1/2 часть колонии пересевают на питательную среду следующего состава, вес.%:

Солодовые ростки3

Крахмал6

НаЫОз. 0,91

КС10,05

M};S04.0,05

KHgPO 0,1

FeS040,001

744

и выращивают в течение 3 сут при . Получают культуру с активноCTbto 117 ед/мл.

Затем активные колонии пересевали в пробирки на агаризованную питательную среду того же состава, что и-для выращивания, вес.%: Крахмал2

КС10,05

MgSOi 0,05

,1

,91

0,001

Агар2

и хранили в течение 3 мес, при этом активность сохранялась на уровне 117 ед/мл. В контрольной неактивированной культуре активность глюкоамилазы через 3 мес была 80 ед/мл. Пример 2. Хранят штамм

Asp. awamori Т-1. Выращивание, активацию и последующий пересев осуществляют на среды, аналогичные в примере 1.

Перед активацией после 12-сутоточного роста культура имела активность 25 ед/мл, после активации 30 ед/мл и сохраняет свою активность в течение 3 мес. В контрольной культуре активность глюкоамилазы в процессе хранения снизилась- до 20 ед/мл.

Результаты свидетельствуют, что при активации культуры на концентрированной агаризованной питательной среде активность увеличивается и сохраняется в течение 3 мес при ее хранении.

В табл. 1 приведена активность ферментов при хранении различными способами.

Таблица,.

Продуцент Asp. awamori

Альфа5,1 амилаза 5, 1

Глюкоамилаза,

80 ед/мл 117

I1118674

Продолжение табл.1

Таблица 2.

1. СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ, ПРОДЛЩРУЕМОЙ ASPERGILLUS AWAMORI В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕ1ШЯ, предусматривающий вьфащивание культуры на агаризованной питательной среде, содержащей крахмал и необходимые минеральные соли с последующим пересевом конидий на хранение в пробирки на питательную среду аналогичного состава, отличающийс я тем, что, с целью повышения глюкоамилазной активности и стабильности ее в процессе хранения, перед посевом конидий на хранение осуществляют активацию культуры путем повторного выращивания ее на концентрированной агаризованной питатель§ ной среде, содержащей водные вытяжки из солодовых ростков и отрубей в (Л соотношении 1:1. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют Q 5%-ную водяную вытяжку из солодовых с ростков и 10%-иую водную вытяжку из ппшничных отрубей.

Пример 3. Выращивание, активацию и пересев проводят аналогично примеру 1, но для активации в составе среды используют водиые вытяжки из солодовых ростков и из пшеничных отрубей различных концентраций.

Результаты представлены в табл.2.

Во всех случаях активность глюкоамилазы сохранялась в процессе хранения в течение 3 мес.

Таким образом, реализация изобретения позволяет повысить активность, гдюкоамипазы и стабилизировать эту активность в процессе хранения.