СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛОПЕПТИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХполимиксинов Советский патент 1972 года по МПК C07K7/62 

Изобретение относится к циклическим йроизводным полимиксинов общей формулы (et) ЛАМ ЛАМ-У-лАМ-ДАМ-ТРЕ И К их получению. В общей формуле (I) различные символы имеют следующее значение; Y - одна из цепочек Д-лей-ТРЕ, Д-фаллсй, Д-лей-лей, Д-лей-йлей; X - радикал общей формулы Ру-СН-О-СО I R где Ру - радикал пи ридина или М-окиси пиридина, незамещенный :или замещенный метильным радикалом; R - атом водорода или алкильный радикал с прямой или разветвленной цепью, содержащий 1-5 атомов углерода, или фенильный радикал. Международный Союз чистой и прикладной химии использует сокращения для обозначения аминокислот. Символ ДАМ обозначает а,7-диаминомасляную кислоту, также было обусловлено, что за исключением противоположного указания аминокислоты имеют L-KOHфигурацию. Циклические пептиДы общей формулы (I) являются новыми прдуктами и могут быть применены в качестве промежуточных продуктов при синтезе полусинтетических производных полимиксинов для модификации боковой цепи, обладающих высокой антимикробной акти вностью, особенно против Грамм-отрицательных микроорганизмов, и имеющих пониженную токсичность по сравненню с полимиксинами, выделяемыми до настоящего времени из смесей, получаемых ферментацией. Продукты общей формулы (I) могут быть присоединены к нолусинтетическим полнмиксинам, так как они содержат только одну свободную аминогруппу, способную к замещению при помощи методов, обычно используемых в химии пептидов. Известно, что полимиксины, полученные ферментацией, имеют различный вид, обычно обозначаемый буквами А, В, Д, Е, М. Эти поК- Л AM- ТРЕ- Ъг- ЛАМ-- 4AM-Y-ЛАМ- ЛАМ-ТРЕ

где К - н-октанил, L-6-метилоктанил или 6метилгептанил;

Y - Д-фал-лей, Д-лей-лей; Д-лей-илей;

Z - ДАМ.

Также известно, что боковая цень иолимиксинов может быть удалена при селективном разрыве пептидной связи, соединяющей указанную цепь с полипептидным циклом без разрыва пептидных связей этого цикла. Для полимиксина Е такое отделение было осуществлено с помощью энзимов. Но продукты, полученные при таком разрыве пептидной связи между боковой цепью и полипептидным циклом, .не пригодны для получения полусинтетических производных, потому что они помимо аминогруппы, освобожденной под действием энзима, имеют некоторое число аминных функций в цикле из-за присутствия звеньев а,7-Дпаминомасляной кислоты в цикле; в самом деле невозможно осуществлять селективное вступление в реакцию амин.ной функции, освобожденной под действием э-нзимов.

Согласно предлагаемому способу аминные функции полипептидного цикла полимиксинов

К Л4Ы-ТРЕ-2 - ДАМ-Д АМ-У-ДAM-ДАМ-ТРЕ

iX X i(IV)

(III)

общей формулы (III) могут быть блокированы с помощью защищающих группировок общей формулы (II). Такие группировки могут быть фиксированы с хорошими выходами на защищаемых аминогруппах. Можно также получить полимиксины, у которых свободные вначале амипные функции, являются блокированными, растворимыми в водной среде, что позволяет подвергать их энзиматическим реакциям при таких условиях рН, температуры и продолжительности реакции, что активность используемых энзимов вызывает специфический разрыв только пептидной связи между боковой цепью и полипептидным циклом полимиксинов, без воздействия на последний.

Кроме того, такие защищающие группировки могут быть легко удалены впоследствии без разрыва полипептидного цикла, например, гидрогенолизом. Наконец, такие защищающие грунпировки, несмотря на модификации, которые они вызывают в цикле, не препятствуют действию энзимов.

Продукты общей формулы (I) по предлагаемому способу могут быть получены из продуктов общей формулы лимиксины могут быть представлены обш,ей

где X, К, Z и Y имеют указанные выЩё значения, аминокислота, представленная символом X, является главным образом носителем одной из группировок, представляемых символом X, когда X означает а,7-диаминомасляную кислоту, при селективном гидролизе пептидной связи, соединяющей линейную боковую цепь с полипептидным циклом. Этот гидролиз осуществляют энзиматическим путем в условиях, подходящих по длительности, темпера гуре и рН.

Различные протеолитические энзимы способны осуществлять этот селективный гидролиз, в особенности протеазы экзоклетчатки, переработанные различными типами Bacilus subtilus, такими, как субтилизин, иагарза, проназа, колистиназа, алказа и еще протеазы, переработанные в. subtilus GLAXO 417, в. subtilus А.Т.С.С.9524 .или Вас. THE 4.

В зависимости от используемого энзима выгодно работать при температуре 20-70°С в буферной среде с рН 5-9.

Продукты общей формулы (IV), в которых символы К, X и Z - имеют указанные выше

аначеиия, могут быть получены из полимйксйнов общей формулы (III) обычными методами, применяемыми в химии пептидов для блокироваиия аминных функций. Особенно удобно вводить во взаимодействие со смешанным карбонатом общей формулы

Р;/ - СИ - О - СО - О - Т(V)

I R

где Ру и ,R имеют значения, указанные вЫще; Т - фенильный радикал или замещенный фенил, например «-нитрофенил, 2,4,5-трихлорфенил, гетероциклический радикал, например радикал хииолил-8 или 2,5-диоксопирролидиНИЛ-1. Реакцию предпочтительно проводить в среде диметилформамида при температуре 15-60°С.

Смешанные карбонаты общей формулы (V) можно получить при действии хлороформиата общей формулы

где Т имеет указанное значение, на снирт общей формулы

Р(/ - СН - ОН(VII)

в которой Ру и R имеют значения, определенные выше.

Эту реакцию предпочтительно проводят в среде нн.ридина примерно при 0°С или в смеси пиридииметилеихлорид при температуре О- 20°С.

Пептиды общей формулы (IV), смешанные карбонаты общей формулы (V) и снирты общей формулы (VII), у которых символ Ру означает радикал N-окиси пиридина, могут быть получены из соответствующих неокисленных продуктов при действии на них такого подходящего окисляюи1его агента, как п-питропербензойная кислота. Обычно работают в среде И1 ертиого органического растворителя, которым может быть спирт, гапример метанол, хлорированный растворитель, иапример хлороформ, или сложиый эфир, папрямер этилацетат, при температуре О-25°С.

Продукты общей с1к)рмулы (I) главиым образом могут быть очитцены с помощью физических методов, таких как перекристаллизация, хроматографи-я или распределеиие в противотоке, или химических методов, таких как преврап1епие в соль присоединения с подходящей кислотой и перекристаллизация ее из соответствующего растворителя с последующим разложением в щелочной среде. В этих операциях природа аниона соли несущественна.

Пример 1. К 109,1 г 3-оксиметилниридина, растворенным в 500 см охлажденного до 0°С пиридина, небольщимн порциями прибавляют цример.ио в течение IV-j час 201, 54 г-«-.нитрофенилхлорформиата.

Реакционную среду перемешивают 1 час при 0°С, нагревают до 20°С и продолжают перемешивать еще 16 час при этой температуре. Прибавляют 1,6 л метиленхлорида, промывают три раза 500 сж дистиллированной воды, затем 500 см насыщенного раствора хлористого натрия. Органический раствор сушат иад сульфатом иатрия, затем упаривают досуха под уменьн1енпым давлением (20 лгж рт. ст.) ири 50°С. Полученное масло растворяют в 1,6 т этанола и выдерживают его 16 час при 0°С. Полученный осадок отделяют фильтрованием, промывают 100 см этанола и сушат в вакууме (0,3 мж рт. ст.). Получают 128 г смещенного карбоната 3-метилпирндила и «-иитрофенила, плавящегося при 93°С (т. пл. определена методом Кофлера).

Rf 0,73 (силикагель; соотиошение метанол : 1,2-дихлорэтан равно 2 : 8 по объему).

Найдено, %: С 57,58; Н 3,86; N 9,89.

Вычислено, %: С 56,94;Н 3,97; N 10,21.

Пример 2. К раствору 3,51 г колистй.на в 140 см диметилформамида прибавляют 16,5 г смешаииого карбоиата 3-метилпириДила и

л-интрофенила. После 48 час перемещивания гф 20°С нерастворивщуюся часть отделяют фильтрованием н фильтрат упаривают досуха iipH умеиьщеииом давлеии (0,3 мм рт. ст.) ири

55°С. Стеклообразный осадок растворяют в 180 см кипящего нитрометана; легкие нерастворимые частицы удаляют фильтрованием. Затем фильтрат выдерживают 2 час ирн 0°С и выделившийся осадок отделяют фильтрованием, промывают его 10 см ледя.ного нитрометаиа, затем сушат иод уменьшенным давлением (0,3 мм рт. ст.) при 50°С в течение 16 час. Таким образом получают 3,85 г пеита- -ииридил-3-метоксикарбоиилколист1 иа.

,74 (силикагель; соотношение н-бутанол : пприднн : уксусная кислота : вода равно 50 : 20 : 6 : 24 по объему).

Найдено. %: С 57,7б: Н 6,67; N 15.78. Вычислеио, %: С 57,28; Н 6,82; N 15,94.

П р И м о р 3. К раствору 1,3 г иснта-Н-ниридил-3-метилоконкарбонилко,писти :а в 150 см метанола ирибавляют 1,3 г п-нитропербепзопHOii кислоты. Реакционную смесь перемешивают примерно при 20°С в течеиие 16 час, потом

упаривают досуха в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50С. Твердый остаток промывают три раза 20 СЛ1 ацетона, затем три раза 20 см- ацетона при 50°С.

После сушки в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при

20°С иолучают 959 мг иента-N-(N-окиси нирилил-3-метоксикарбонил)-колистнна.

,32 (силикагель; соотиощение н-бутаиол : ииридин : уксусная кислота : вода равно 50 : 20 : 6 : 24 по объему).

Пример 4. К суспензии 2,17 г полпмнксниа В в 145 см диметилформамида ирибавляют 3,18 г смешанного карбоиата N-окиси 3-метил-пиридила и я-нитрофеннла. После 24 час неремешиваиия при 60°С и 65 час перемешивания ц.ри 20°С иерастворивщуюся часть отфильтровываЕОт. Фильтрат упаривают досуха в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при 60°С. Остаток растворяют в 7 см метанола и раствор хроматографируют на колонке с сефадексом

LH 20 (диаметр колонкн 38 мм; высота 1,80.и). Элюируют метанолом, собирая фракции по 7 с.адз.

Собирают фракции 130-170 и упаривают досуха в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50°С. ТаКИМ образом получают 3,2 г пента-N-(N-окиси

3-метилпиридилоксикарбонил)-полимиксина В.

,30 (силикагель; соотнощеиие н-бутаиол : пирндии : уксусная кислота : вода равио

50 : 20 : 6 : 24 но объему).

Пример 5. К раствору 5,45 г 3-оксиметилпириднна в смеси 3,95 г пиридииа и 45 см метиленхлорида но каплям прибавляют в течение 20 мин, выдерживая температуру реакциоииой среды ииже 35°С, раствор 13 г хлорформиата 2,4,5-трихлорфенила в 20 см метиленхлорида. Через несколько минут после окончания прибавления хлорформиата выделяется желтый осадок. Продолжают перемешивание реакционной смеси в течение 20 час

Элюируют смесью метаиолдиоксан (95-5 по объему) и собирают фракции по 50 см. Собирают фракции 22-60 и рпаривают нх досуха в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50°С. Таким образом получают 3,25 г цикдо-Ы Z-,,,-диаминобутирил-.г-., -(N-окиси 3-метилпиридклоксикарбонил)-7 -, ., -диаминобутирилД-леЙ1 Ил-7-лейцил-Ы. -Н-окись 3-метилпиридилоксикарбонил- (Z,-, -; -днамннобутирИЛ-N , )N-окись 3-метилпиридилоксикарбонил- (Z с,, днаминобутирил-Е-треонил).

Приготовление буферного раствора с рН 6 н Определение титра энзима такие же, как в примере 6.

Пример 10. К раствору 3,17 г пента-N(N-окиси 3-метилпиридилоксикарбоЕИл) -полимиксина В -в 634 см буферного раствора с рН б прибавляют 1,02 г ш;елочной протеазы, переработанной В. subtilus (титр 9,5 и/мг) и реакционную смесь 3 час перемешивают при 22°С. Тотчас же после перемешивания доводят рН реакционной среды до 3 добавлением 1 и. соляной кислоты. Нерастворившуюся часть отфильтровывают, затем фильтрат досуха упаривают в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50°С. Получают порошкообразную пасту, которую растворяют -в 60 см дистиллированной воды; к раствору прибавляют 60 см Амберлита IRA 400 (ОН-форма). Смесь перемешивают в течение 1 час, фильтруют, промывают смолу 200 см дистиллированной воды и лиофилизируют водную фазу. Получают твердый продукт, который извлекают 50 см метанола. Перемешивают 1/2 час. Отфильтровывают нерастворимую часть и три раза промывают 15 см метанола. Фильтрат упаривают досуха в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50°С. Полученный твердый остаток растворяют в 5 см раствора метанол-диоксан (95--5 по объему) и раствор хроматографируют на колонке .с окиСЬЮ кремния (высота колонки 70 см; диаметр 1,8 см). Элюируют смесью метанолдиоксан (95-5 по объему), собирая фракции по 25 см.

CHs

Таким образом получают циклo- N - Z,, f.диаминобутирил-Му - (N-окиои З-метилпиридилоксикарбонил) -Z,., v -диаминобутирил-Дфенилаланил-2-лейцил-Ы v -N-окись 3-метилпиридилоксикарбонил-(Z.-, 7 - диаминобутирил-N,. )-N-окись 3-метилниридилоксикарбонил ,,,-f-диа,ми1 обутирил-М; )-N - окись-З-метилпиpидилoкcикapбoнил(Z.,, , - диаминобутирилтрсонил).

Rf 0,27 (силикагель; соотношение н-бутанол : пиридин : уксусная кислота : вода равно 50 : 20 : 6 : 24 по объему).

Приготовление буферного раствора с рН 6 и определение титра энзима такие же, как в примере 8.

Пример 11. К раствору 55 мг пента-N(N-OKHCH 4-метилпиридилоксикарбоннл) - колистина, приготовленного, как описано в примере 3, В 12 см буферного раствора с рН 6 (приготовленного, как в примере 8) прибавляют 2 мг переработаиной В. subtilus THE 4 протеазы и перемешивают реакционную смесь 2 час при 20°С.

Сразу же устанавливают рН реакционной смеси равным 3 добавлением н. соляной кислоты. Реакционную смесь охлаждают до -70°С и лиофилизи-руют. Полученный твердый остаток растворяют в 4 см метаноля и хроматографируют на колонке, содержаще в нижней части 5 г силикагеля, а в верхней части 5 г окиси алюминия (диаметр колонки 10 мм, высота 30 см). Элюируют смесью метанолдиоксан (95-5 по объему), собирая фракции по 4 мл фракции с по 11 объединяют, упаривают досуха в вакууме (15 рт. ст.) при 50°С.

Таким образом получают 10 мг циклo- N.f Z,, , -диаминобутирил-Nj -(N-окиси 4-метилпиридилоксикарбонил) -Zс-, ; - диаминобутиpил-Д-лeйцил-Z-лeйцил-Nv -N-окиси 4-метилпиpидилoкcикapбoнил-(Z „.-, - диаминобутирил-Ni -)-N-окиси 4-метилпиридилоксикарбопил- (Z „, 7 -диaминoбyтиpил-Z-т.peoнилa).

,24 (силикагель; соотношение н-бутанол : пиридин : уксусная кислота : вода равно 50 : 20 : 6 : 24 по объему).

Структура продуктов обшей формулы (I), также как и эффективность процесса были доказаны синтезом из продуктов обшей формулы (I) уже известных нолимиксинов, получаемых до настоящего времени ферментацией.

Например, получают полимиксин Е, называемый также колистином .Л, при действии продукта общей формулы (I), в котором символ Y представляет собой соответственно Длeйцил-Z-лeйцин, а символ X означает радикал N-окись 3-метилпиридилксикарбонила, на продукт общей формулы:

СНз

шш,

9НОН

(СН,),

где символ Ri - защищающая группировка аминной функции, лабильной при гидрогенолизе, например, бензилоксикарбонильная группа или группа общей формулы (II);

Rs - активированная карбон.иль-ная функция, обычно используемая в химии пептидов, такая, как азидогруппа, полученная из соответствующего гидразида п.ри действии азотной кислоты. После удаления защищающих группировок получают продукт, идентичный полимикоину ЕЬ полученному ферментацией.

Пример 12. К суспензии 200 мг колистина в 10 см диметилформамида прибавляют 400 мг смещанного карбоната N-окиси 4-метилпиридила и я-нитрофенила. После 64 час перемешивания при 20°С раствор упаривают досуха в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при 55°С. К стеклообразному остатку прибавляют 10 см эфира; выпавщие кристаллы отфильтровывают, промывают два раза 3 см эфира и сущат в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при 20°С.

Таким образом, получают 250 мг пента-N(N-окиси 4-метилпириД|Илоксикарбонил)-колистииа.

Rf -0,29 (силикагель; соотнощение н-бутанол : пиридин : уксусная кислота : вода равно 50:20:6:24.

Пример 13. К раствору 1,5 г neHTa-N-(Nокиси З-метилпиридилоксикарбонил) -колистина в 230 см буферного .раствора с рН 7,5, нагретого до 37°С, прибавляют 50 мг субтилизина и реакционную смесь перемещивают при 37°С е течение 15 мин, тотчас же смесь охлаждают до -70°С.

Лиофилизация полученного таким образом раствора приводит к крему, который растворяют в 10 см тяжелой фазы системы растворителей следующего состава,

н-Бутанол800

Пиридин200

Уксусная кислота100

Вода900

Этот раствор подвергают распределению в противотоке в аппарате из 60 трубок, каждая из которых содержит 10 см тяжелой фазы и 10 см легкой. К коицу распределения содержимое каждой трубки упаривается досуха в вакууме (25 мм рт. ст.) при 65°С. Остаток в трубках с 25 по 31 растворяют в 20 см воды и полученный таким образом раствор лиофилизируют. Получают 246 мг цикло- Ы- -Z,-,диаминобутирил-Ыу -(N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил) -Zr,, -, -диами.нобутирил-Длейцил-2-лейцил-М7 -М-окиои 3-метилпиридилоксикарбонил)-2,, Y -диаминобутирил-Nf ) N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил- (Z я, диаминобутирил-7-треонина).

Rf 0,27 (силикагель; соотношение «-бутанол : пиридин : уксусная кислота : вода равно 50 : 20 : б : 24 по объему).

После гидролиза общий анализ на автоанализаторе Technilon показал наличие следующих аминокислот: Dab 4,07 (теория 4), Len 2,00 (теория 2), Ths 0,98 (теория 1).

При работе аналогичным образом, но заменяя субтилизин на наргазу, проназу, колистиназу, алказу или на протеазы, переработанные В. subfilis GZ АХО 417, В. subfilis

А.Т.е.С. 9524, THE 4, получают также полипептидный цикл, описанный выще, идентифицированный хроматографией на силикагеле (,27; соотнощение м-буталол : пиридин : : уксусная кислота : вода равно 50 : 20 : 6 : 24

по объему).

Буферный раствор с рН 7,5, использованный для растворения пента-N-(N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил) -колистина, может быть получен при введении 34 сл4 уксусной

кислоты в 700 см дистиллированной воды при рН 7,5 (определено на рН-метре) при добавлении 5 н. аммиака и доведения раствора до общ,его объема 1000 см добавлением дистиллированной воды.

Пример 13. К раствору 63 мг N« -метил-60 ;тaнил-Nv -бензилоксикарбонил-Z, -диаминобути-рил-7-треиил-1М ( -бензилоксикарбокилZ-, V -днаминобутирилгидразида в смеси

1,6 см уксусной кислоты и 0,178 см 1 и. соляной кислоты, охлажденному до 0°С, прибавляют 6,2 мг нитрита натрия в виде раствора в 0,1 см дистиллированной воды. После 20 мин перемешивания цри 0°С реакционную

смесь выливают в 20 см дистиллированной ледяной воды. Вынавщий белый осадок отфильтровывают при 0°С и промывают 20 см ледяной дистиллированной воды. Этот осадок прибавляют к ледяному раствору 100 мг циклo- N-f- Z,, t-диаминобутирил-N-f -(N-окиси 3метилпиридилоксикарбонил)-7у г,. -диаминобyтиpил-Д-лeйцил-Z-лeйцил-NY j-N-окис.и 3-метилпиридилоксикарбонил-(Z,, Y -диаминобутиРИЛ-NY )-N-окиси З-метилпиридилокоикарбонил-(Z, f-диаминобутирил-треонила). После 20 час выдержки при 2°С реакционную смесь упаривают в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при 60°С. Полученное масло извлекают 20 см эфира. Образовавшийся осадок отфильтровывают и два раза промывают 10 см воды.

После сущки в вакууме (0,3 Л1м рт. ст.) при 20°С получают 106 мг и,якло-,-{N,.-м&тил-б-октанил-NY -бензилокснкарбонил-Z,, Y диaминoбyтиpил-Z-тpeoнил-N-f -бензилоксикарбонил-Z с,, Y-Диaминoбyтиpил)-NY , Z,, Y -диаминoбyтиpил-Д-лeйцил-Z-лeйцил-lN.f -N-окиси 3мeтилпиpидилoкcикapбoиил-.(Z„,-f -диаминобутирил-N-f )-N-окиси 3-метилпнридилоксикарбонил- (Zc,, 7 -диaминoбyтиpил-Z-тpeoнилa).

,51 (силикагель; соотнощение к-буганол : пиридин : уксусная кислота : вода равно 50 : 20 : 6 : 24 по объему).

Пример 14. К раствору 90 мг циклo- NY

-(Na -метил-б-октанилбензилоксикарбоннл-Za, Yдиaминoбyтиpил-Z-тpeoнил-NY -бензилоксикарбонил-Z,,, ;-диaминoбyтиpил-N-f )-N-OKCH 3-метилпирндилоксикарбонил- (Z „, -, -диаминобути13

N-f )-N-OKHCH З-метилпиридилокоикарбонил(Z,, ;-диаминобут.ирил-7-треонила) в 7 см .метанола и 1 см 1 н. соляной кислоты прибавл5 ют 100 мг палладия на угле 3,15 и в течение 16 час пропускают слабый ток водорода. После фильтрования И упаривания фильтрата досуха в авкууме (25 мм рт. ст.) при 50°С получен-ныи твердый остаток растворяют в I см метапола н раствор хроматографируют на колспке, зяиолненной 40 г .сефадекса LH 20 (диаметр колонки 14 мм, высота 1,7 м). Элюируют метанолом, собирают фракции по 3 объединяют фракции 33-35 и разбавляют их 10 см дистиллированной воды, полученный раствор лиофилизируют. Таким образом получают 32 мг нентахлоргидрата колиипа А.

,29 (силикагель; соотношение н-бутанол : пиридин : уксусная кислота : вода равно 50 : 20 : 6 : 24 по объему).

Полученный таким образом .колиин идентичен природному колиину А.

К ЛАМ-TPE-Z ММ-Л AM-Y-ЛАМ-ЯАМ-ТРЕ

где К - н-октанил, L-6-метилоктанил или 6-метилгептанил;

Z - Д-сер или Д-ДАМ;

X и Y имеют значения, указанные выще, подвергают селективиому гидролизу с по14

Предмет изобретения

Способ получения циклопептидпых производных полимиксинов общей формулы (oL) ЛА.М-ДАМ-У-/1АМ-/ АМ-ТРЕ

i i i I U)

где Y - одна из цепочек Д-лей-ТРЕ, Д-фаллей, Д-лей-лей, Д-лей-илей; X - радикал общей формулы

I Ру-СН-О-СО,

в которой Ру - пиридил или метилпиридпл или радикал N-окиси пиридииа, присоеди.неиный через у-аминную группу аминокислоты, а R H, алкил с числом атомов углерода 1-5, фенил, отличающийся тем, что производные полимикоииов общей формулы

J

мощью протеолитических эизнмов, например нроиазы, «агарзы, колистииазы, субтилизлна, при температуре 20-70°С, рН 5-9 и продол25 жительности процесса более 3 суток.