СССРЗависимый от патента № — Заявлено 17.IV.1968 (№ 12;ЗЭ3513/3'1-16) Приоритет 18.IV. 1967, № 15056—А/67, Италия Опубликовано 17.IV.1973. Бюллетеиь № 18 Дата опубликования описания 15.VI.1973-и ^'•^«^o^-xJr, ;fW,.,._*•* -!'ЯЛЯ :биолиSlil^biSAМ. Кл. С 12d 9/14А 61k 21/00УДК 615.779.а31(088.8) Советский патент 1973 года по МПК C12P1/06 A61K35/70 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способам получения антибиотиков, в частности адриамицина.

Способ получения адриамицина в литературе не описан.

Целью изобретения является получение противоопухолевого антибиотика. Эта цель достигается тем, что культуру Streptomyces peucetius F. i. 106 инкубируют в аэробных условиях на жидкой среде, содержащей источНИКИ углерода, азота и минеральные соли, в течение 3-7 суток при 25-37°С и начальном рН 6,5-7,0, культуральную жидкость или в отдельности мицелий и нативный раствор экстрагируют органическими растворителями и из экстракта выделяют целевой продукт и подвергают его очистке известными приемами.

Пример 1. Приготовляют две колбы Эрленмейера емкостью по 300 мл, содержащие 60 мл культуральной среды для вегетативной стадии. Состав данной среды берут следующий: пептон - 0,6%; сухие дрожжи - 0,3%; гидратный нитрат кальция - 0,05%; водопроводная вода. Величина рН после стерилизации составляет 7,2. Стерилизацию осуществляют нагреванием раствора в стерилизациоином автоклаве при 120°С в течение 20 мин. В каждую колбу вносят количество мицелия мутанта F. 1.106, соответствующее /5 суспензии в

стерильной воде мицелия из десятидневной культуры, выращенной в большой пробирке и в среде следующего состава: сахароза - 2%; сухие дрожжи - 0,1%; дикалийфосфат 0,2%, азотнокислый натрий- 0,2%; сернокислый магний - 0,2%; агар - 2%; водопроводная вода. Колбы, поставленные на ротационной мешалке с эксцентричностью 30 мм и скоростью 220 об/мин выдерживают в термостате нри 28°С в течение 48 час. Так выращенную вегетативную среду вносят в количестве 2 мл в 300-миллилитровые колбы, содержащие 60 мл среды для продуктивной стадии. Состав данной среды следующий: глюкоза - 6%; сухие дрожжи - 2,5%; хлористый натрий - 0,2%; дикалийфосфат - 0,1 %; углекислый кальций - 0,2%; сернокислый магний-0,01%; сернокислое железо - 0,001 %; сернокислый цинк - 0,001 %; сернокислая медь - 0,001 %; водопроводная вода. При этом получают рН равное 7. Этот раствор стерилизуют при в течение 20 мин; глюкозу стерилизуют раздельно тоже в течение 20 мин при 110°С. Получеиный раствор выдерживают в термостате при 28°С и в том же режиме взбалтывают, как для вегетативной среды.

Наибольшую коицентрацию антибиотик достигают на шестой день брожения. Количество продуцируемого адриамицина в этом возрасте соответствует концентрации 15 . Пример 2. Этот пример отличается от предыдущего тем, что посевную культуру выращивают в следующей твердой среде: 200 г очищенного картофеля варят в 500 мл воды в течение 20 мин объем доводят до первоначального значения и профильтровывают через марлю. Добавляют 2% глюкозы, 0,1% дрожжевого экстракта Дифко и 2% агара. Объем доводят до 1 000 мл и смесь стерилизуют при 120°С в течение 20 ишн; рН равно 6,8-7. Наибольшая концентрация адриамидина - И мкг/мл и получена в 140-й час обработки. Пример 3. Этот метод отличается от предыдущего применяемыми вегетативной и продуктивной средами, состав которых берут следующий: Вегетативная среда: крахмал - 3%; углекислый кальций - 0,4%; барда - 0, сернокислый аммоний - 0,1 %; казеин - 0,5%; дикалийфоофат - 0,01%; водопроводная вода. После стерилизации в автоклаве при 120°С в течение 20 мин рП равно 7. Продуктивная среда: крахмал - 5%; углекислый кальций- 0,8%; кукурузный экстракт - 0,6%; казеин - 0,5%; сернокислый аммоний - 0,1%; дикалийфосфат - 0,01%. После стерилиза ции рП составляет 7. Стерилизацию проводят в том же порядке, как для вегетативной стадии. Максимальное производство получают на седьмой день с концентрацией 6,5 мкг/мл. Пример 4. Культуру мутанта F. i. 106 в твердой среде, как описапо в примере 2, инокулируют в 500 мл жидкой среды вегетативной стадии, описанной в примере 1, и содержащейся в колбе из стекла пирекса емкостью 2000 мл. Поставив колбу на вращающийся взбалтывающий прибор, работающий со скоростью 120 об/мин и эксцентричностью 3,5 мм, смесь выдерживают при 28°С в течение 48 час. Затем 100 мл так полученного культурального бульона инокулируют в 3000 мл той же жидкой среды, содержащейся в 5-ли11ровом ферментере из нейтрального стекла. Этот прибор должен быть снабжен винтовой мешалкой, трубой подачи воздуха для борботера, установленного под винтовой мещалкой, волноломом, трубой для инокуляции, выпускной трубой воздуха, аппаратурой для контроля температуры и устройством для периодического или непрерывного добавления при стерильных условиях. Выращивание проводят при 28°С с расходом воздуха продувания 3 л/мин и скоростью 400 об/мин перемешивающих винтов. После 24 час 300 мл так выращенного культурального бульона израсходуют для посева 6 л продуктивной среды, описанной в примере 1 и содержащейся в 10-литровом ферментере из нейтрального стекла, обладающем вышеописанными характеристиками. Во время брожения, проведенного со скоростью неремешивания 350 об/мин и при продувании воздухом 5 л/мин, добавляют небольшое количество силиконового противовспенивателя. Ыаибольишя продукция, полученная за 150 час брожения, соответствует концентрации адриамицина 6 мкг/мл. lip и мер 5. Культуру, полученную, как описано в примере 1, инокулируют в 2000миллилитровую колбу, содержащую 500 Л1Л среды следующего состава: пептон - 0,6%; зерненные сухие дрожжи - 0,5%; азотнокислый кальций в воде - 0,05%. Среду паремешивают иа вращающемся взбалтывающем ириборе в течение 48 час при . Полученную культуру засевают к 50 л вышеуказанной среды, содержащейся в 80-литровом ферментере, и перемешивают со скоростью 230 об/мин и с расходом продуваемого воздуха 0,7 л/л среды/жин при 27°С. После 4-5 час культуральный бульон готовят для носева 500 л культуральной среды в 800-литровом ферментере. Состав сбраживаемой среды следующий: глюкоза - 7%; путовая мука - 6,657о; углекислый кальций - 0,2%; хлористый натрий - 0,2 %; дикалийфосфат - 0,1 %; гептагидрат сернокислого магния - 0,02%; гептагидрат сернокислого железа - 0,000687о; гептагидрат сернокислого марганца - 0,001%, сернокислая медь -0,002%; водопроводная вода. Среду стерилизуют нри 120°С в течение 30 мин, охлаждают до и иосле засева перемешивают со скоростью 250 об/мин и продувают при расходе воздуха 0,4 л/л ср&д,ы1мин. После 145 час в культуральном бульоне содержится 6,5 мкг/мл адриамицина. Пример 6. 60 л культуральпой жидкости, полученной брожением, как в примере 4, отфильтровывают от мицелия с помощью Суперцел (зарегистрированная фабричная марка) с получением лепешки и фильтрата, которые экстрагируют отдельпо; затем полученную лепешку суспендируют в ацетоне, разбавленном 0,1 н. водяным раствором серной кислоты (4:1) и перемешивают в течение 2 час. После этого фильтруют жидкость, а лепещку перемешивают дважды. Полученные экстракты собирают и нейтрализуют, а ацетон испаряют в вакууме. Концентрат, в котором содержится около 0,25 г адриамицина, подкисляют до рНЗ с помощью соляной кислоты, после этого экстрагируют хлороформом для удаления процента примесей. Жидкую фазу доводят до рН 8,6 1 н. раствором едкого натра, а затем экстрагируют смесью хлороформ-метанол (9: 1). Эту операцию повторяют до полного обесцвечивания жидкой фазы. Экстракты хлороформ-метанол промывают водой до досшження рП 8,6, а затем опять экстрагируют 0,01 н. растворо.м соляной кислоты до окрашивания жидкой фазы красным цветом. Хлороформную фазу удаляют, а жидкую - фильтруют и доводят до рП 8,6 посредством 1 н. раствора едкого натра и, наконец, экстрагируют при помощи смеси хлороформ-метанол (9:1). Экстракт, в котором, помимо разных примесей, содержится 0,15 г адриамицина, промывают водой до достижения рН 8,6, затем высушивают безводным сернокислы.м натрием,