СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОПРЕЦИПИТИНА Советский патент 1973 года по МПК A61K35/78 

1

Изобретение относится к области бакте.рИОЛО;ГИИ л биологии.

Известен способ оолучения фитопреципитина, соглашо ,котор01му гороховую муку экстрапируют раствором хлорида «ат|рия, центрифугируют, осаждают белок дабавлением этанола, центрифугируют, добавляют 2 и. раствор NaOH до РН 7,5, лиофилизируют. Полученный Преципитин не требует адсорби1роваиия. Однако, фитопрацитития таки/м способом получают в аморфном виде.

Цель изобретения - -получение фитолреципитина в кристаллическом виде, что повышает его качество.

Это достигается тем, что белок осаждают сульфатом а . в кислой среде, адсорбируют ,на декстрановом геле из фосфатного буфера, содержащего IVo хлористого наирия, рН 7,5, элю.ируют тем же буфером с добавкой 0,5 моль глю-козы с последующим лереосаждением и кристаллизацией из спирто-водного раствора при рН 5,6 и тамлературе 4-5° С.

Пример:

1.Высаливание. 0,5 кг муки из лущенного гороха акстрагуют 1,5 л 1%-;ным pa-CTSopOiM хлористого натрия 4 час ,при перемешиваний и затем центрифугируют 15 мин.

2.Высаливание аммоний сульфатом. К полученному экстра.кту дОбащляют аммоний сульфат до 0,3 насыщения (19 г/100 мл), осадок удаляют центрифугированием 15 мин. при 3000 об/мин. К надосадочной жидкости добавляют айшоний сульфат до 0,6 насыщения (20 г/100 мл) и осадок, содержащий дреципитИН, собирают центрифугированием. Выход составляет 28 г белка.

3.Высаливание в кислой среде. Осадок белка, полученный на предыдущей стадии, растворяют в 50 мл воды, добавляют 1 н. соляной кислоты до рН 2-2,5 (около 0,1 объема) и изл1еряют общий объем раствора. Вычисляют степень насыщения аммоний сульфатом (насыщение осадка принимают равным 0,6) и добавляют насыщенный раствор а.м-моНИИ сульфата до 0,3 насЫ|Щвния. Осадок удаляют центрифугированием. К надосадочной жидкосБИ добавляют твердый аммоний сульфат до 0,6 насыщения. Осадок собирают центрифугированием и подсушивают на воронке Бюхнера. Выход составляет 5 г белка.

4.Адсорбция на геле «Сефадекс Г-150. Осадок белка растворяют в 15-20 мл воды и нейтрализуют едким натром до рН 5,6. Зате.м раствор разбавляют водой в 4 раза и образовавшийся осадок через 30 .иан удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость доводят до рН 7,5 едким натром и наносят на колонку размером 10X20 с.и, залолченную гeлeJM Сефадакса и уравновешенную 0,03 М фосфатнылг буфером, содержащим 1 %

:

хлористого натрия, рН 7,5. Колонку про.мы.вают б} фером до исчезНовения .беЛКа в элюате. Фитопреципнтин, адсорбироваиный на геле, элюируют там же бу-фером, к .которому добавляют глЮ|Козу до 9% (0,5 моль). Вытекающую Ж1ид. собирают на .коллекторе фракции и пробы, содержащие .белок, объеднияют. Фптопреципитин элюируют в 0:бъе1ме 150-200 мл; его осаждают амлюний .сульфатом ири 0,6 насыщения. Въгход - 0,25 2 бел1ка.

5.Кристаллизация. Для удаления неорганических солей (аммоний сульфат) осадо.к прецииитииа (0,25 г) растворяют в 5 мл воды, устанавли1вают рН 5,6 помощью 1 н. уксусной кислоты. Затем постепенно добавляют 1,5 объема .этанола, не долуская подъема температуры выше 20° С, для чегопосудину со смесью о.хлаждают водопроводной водой. Осадок центрифуги(руют, растворяют в 5 мл воды и повторно осаждают этанолом. После вторичного центрифугирования осадок растворяют в 4 мл воды, раствор осветляют центрифушроваиием лри 7000 об/мин и оставляют при 4°С на 24 час. При стоянии в.ыпадают кристаллы, которые имеют форму тетраэдров с выпуклыми граня1ми.

6.Перекристаллизация. Кристаллы растворяют в воде при рП 8 ((концентрация белка

4

3-4%), небольщую муть удаляют центрифупиройанием, после чего рН доводят до 5,6 и добавляют неоколько Капель слирта. Оставляют :на 24 час при 4°С.

Количество получаемого белка составляет 400-500 мг из 1 кг гороха, степень очистки- 150 раз.

Все операции, .KpOiMe специально указанных, Про.воцят три комнатной температуре. Активность Приципитина на различных стадиях очистки контролируют методом гемаглюгинадни в пробирок ах.

Предмет изобретения

Способ получения фито прец1ипит1ина путем экстракции гороховой муки раствором хлорида натрия, осаждения бел1ка и его очистки, отличающийся тем, что с целью повыщения качества целевого продукта, белок осаждают сульфато1М а1М.мон1ия ,в кислой среде, адсорбируют на декстрановом геле из фосфатного бз-фера, содержащего 1% хлористого натрия, рН 7,5, элюируют тем же буфером с добавкой 0,5 моль глюкозы с последующим переосаждением и кристаллизацией из сииртоводного раствора при рН 5,6 и температуре 4-5° С.