ШТАММ TRICHODERMA VIR1DE ГЕН-К9-10-ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ1 Советский патент 1973 года по МПК C12N1/14 C12N9/42 C12N15/01 

Среды

1.Колония занимает всю поверхсреда Чапека

ность чашки.

2.Воздушный мицелий тонкий,

стелющийся, бесцветный

3.Конидий в желтых подушечках,

расположенных компактно в центре колонии и редко ио периферии.

4.Среда не окрашена.

1.Диаметр колонии 65 мм.

среда

крахмалом

2.Воздушный мицелий ползучий, едва заметный, бесцветный.

3.Конидий не образуется.

4.Среда не окрашена.

1.Колония занимает всю поверхность чашки.

2.Воздушный мицелий белый, войлочный, хорошо развит по всей поверхности колонии.

3i Конидии в желтых или беловатых подушечках, расположенных по всей поверхности колонии.

4. Среда окрашена в светло-желтый цвет.

1.Колония занимает всю поверхсреда по прописи с добавлением 1% ность чашки.

2.Воздушный мицелий бесцветный, экстракта тонкий, распростертый.

3.Конидии в беловато-зеленых подушечках, расположены в центре колонии и редко по периферии.

4.Среда не окрашена.

феля

1.Рост ограничен только по штриху.

2.Воздушный мицелий развит хорошо, бесцветный.

3.Конидии в зеленых подушечках.

4.Субстрат не окрашен.

Послойное разжижение наблюдается к 6-7-му дню инкубации.

е, рН 6,3)

Молоко пептонизирует быстро рН среды не меняется

Восстановление наблюдается к 10-му дню инкубации

Крахмал гидролизует слабо.

Примечание. На жидких средах с различными источниками углерода, (глюкозой,, галактозой, лактозой, мальтозой, ксилозой, маннозой, рзмнозой, сахарозой и глицерином) существенных различий в характере роста не наблюдаете а.

Таблица 1

Ген-К9-10

L Д(аметр колонии 90 мм.

2.Воздушный мицелий тонкий, слегка ириподнимающшТся, бесцветный.

3.Конидии в виде зеленых подушечек, расположенных в центре.

4.Среда окрашена в яркий зеленовато-желтый цвет.

1.Диаметр колонии 34 мм.

2.Воздушный мицелий паутинообразный, Г1ринаднимаюш.ийся, бесцветный

3.Кон:ДИ11 в виде редких зеленых подушечек в месте укола.

4.Среда не окрашена.

1.Диаметр колонии 70 мм.

2.Воздушный мицелий бесцветный, ирижатый, с хорошо выраженными концентрическими окружностями.

3.Конидий не образуется.

4.Среда окрашена в желтый цвет.

1.Колония занимает почти всю поверхность чашки.

2.Воздушный мицелий бесцветный, тонкий. Хорошо выражена радиальная исчерченность.

3.Конидий не образуется.

4.Среда не окрашена.

1.Рост очень интенсивный, захватывает всю поверхность ломтика.

2.Воздушный мицелий нуш11стый, желтый.

3.Конидиеобразовапие обильное.

4.Субстрат .нтснсивно окрашен в ярко-желтый цвет.

Разжижения не наблюдается вплоть до 30 суток инкубации

Молоко пептонизирует медленно рН среды 7,7-7,8

Слабое восстановление наблюдается к 30-ым суткам инкубации

Крахмал гидролизует интенсивно.

Характеристика цитологических особенностей штамма Trichoderma viride Ген-К9-10 в сравнении с исходным штамл:о.у1 Trichoderma viride Л 1 на синтетической среде Чапека

№ 1

1.Набухание конидий через 8-10 час инк.убации.

2.Прорастание конидий через 16 час инкубации, как правило, с одиого конца, редко с двух.

3.Гифы длинные, волокнистые, слегка разветвленные, окрашены интенсивно.

4.Конидиеносцы формируются к 49 час инкубации, ветвистые.

5.Зрелые конидии появляются через 96 час инкубации. Конидиеобразование си.чьное.

6.Конидии крупные, овальные, окрашены в синий цвет с ярким красным ядром.

7.Лизис культуры наблюдается через 144 час инкубации.

Штамм Ген-К9-10 хранят в виде лиофильио высушенных конидий культуры в стеклянных амнулах.

Питательные среды для выращивания посевного материала и ферментации штамма Trichoderma viride Ген-К9-10.

Среда для выращивания посевного материала. Агаризованная среда но иронией Роулен-Тома с добавлением 1 % кукурузного экстракта.

Среда для ферментации, %: Свекловичный жом4,0

(NH4)2SO40,14

КН,Р040,1

MgSO..0,03

СаСЬ0,03

Мочевина0,3

Микроэлементы, мг/л среды: FeSO.-7H,01,0

ZnCIs0,8

MnS04-I bO0,5

Сравнение уровней биосинтеза целлюлолитическйх ферментов штамуом Trichoderma viride Геи-К9-10 и штамуом Trichoderma viride № 1

Ген-К9-10

1.Набухание конидий через 4-6 час инкубации.

2.Прорастание конидий через 8-10 час инкубации, как правило, с двух концов, иногда с трех.

3.Гифы длинные и короткие, сильно искривленные, ветвистые, окрашены интенсивно.

4.Конидиеносцы формируются к 24 час инкубации, сильно ветвистые.

5.Зрелые конидии появляются к 30 час инкубации. Конидиеобразование менее обильное, че.м у штамма

.42 1.

6.Конидии меньшего размера, чем у штамма № 1. Форма и окраска те же.

7.Ли&ис культуры наблюдается через 72 час инкубации.

СоСЬ-бНгО

0,5 10,0 20.Моз-2Н2Р04-48Н2О или (NH4)6-4H2O М07О24

10,0

рН 4,0-4,2

Выращ.ивание посевного материала и условия ферментации. Культуру штамма Trichoderma viride ГенК9-10 выращивают четверо суток при 28°С на скощенном агаре (по прописи Роулен-Тома с добавлением 1% кукурузного экстракта). Посевным материалом служит водная суспензия конидий культуры, выращенной на агаризованной среде. Количество инокулята 5-10% от объема засеваемой среды.

Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл. Объем среды 50 мл. Инкубация 7 суток при 28°С на качалках, вращающихся со скоростью 220-250 оборотов в мин.

7

В условиях опытной установки ферментацию осуществляют в ферментерах емкостью 20 л. Объем среды 10 л. В качестве пеногасителя .используют кашалотовын жир Использованные методы

Условия инкубации

реакционных смесей

темперавре.чя тура, С

О|безжиренный хлопок 25 мг

50 Айетатный буфер 0,1 моль, 0,5 мл

96 час определения количества лг

Н 5,0 ргдукцирующих сахароз по методу Сомоджи-Нельсона в

фильтрат культуральной 2.5 мл .модификации Родионовой жидкости в соответствующе.ч разведении

.Смешанные древесные 50 мг

опилки Натрий-цитратный буфер 1,0 мл

50

24 час

0,05 моль, рН 4,8 Фильтрат культуральной 1,0 л/г

жидкости в соответствующе1М разведении

.Размельченная фильтро- 10 Л1г

вальная бумага (фильтрат № 3)

Ацетатный буфер 0,1 MO,II , 2,0 мл

50

1 ч.ас рН 4,7

Фильтрат культуральной 0,5 мл Жидкости в соответствующем разведении

.Раствор натрий-карбокси- 2,5 мл

50

1 час

метилцеллюлозы (степень полимеризации 350, степень замещения 55), приготовленный на ацетатном буфере 0,05 моль, рН 4,5. Концентрация 0,3% Фильтрат культуральной 0,5 мл жидкости в соответствующим разведении

.Раствор натрий-карбокси- 5,0 мл

Метил целлюлозы (данные те же, что в п. 4), приготовленный на дистиллироisaHHofi воде

Ацетатный буфер 1 моль, 0,5 .«л

О, 2, 4,

50 рН 5,6 6 мин

Фильтрат культуральной 0,5 мл жидкости в соответствующем разведении

Предмет изобретения

Штамм Trichoderma viride Ген-К9-10-продуцент целлюлолитическнх ферментов. Культур а льно-морфологические иризнаки.

Синтетическая среда Чанека. Посев уколом. Через 7 суток роста при 28°С диа.метр колоний 90 мм. Воздушный мицелий тонкий, слегка приподнятый, бесцветный. Конидий в виде зеленых подушечек, расположенных в центре. Среда окрашивается о яркий зеленовато-желтый цвет.

Синтетическая среда с крахмалом. Посев уколом. Через 12 суток роста при 28°С диаметр колонии 34 мм. В месте укола образу(0,4 об. %). Объем подаваемого воздуха 1 : 1 в мин. Перемешивание со скоростью 700 оборотов в MtiH. Продолжительность ферментации 7 суток. Температура инкубации 28°С.

Таблица 3

Методы определения

Единицы выражения активности активности

Калориметрический метод

Количество глюкозы, мг, образующейся при действии на субстрат 1 мл неразведенного фильтрата культуральной жидкости

Изменение обратной велиВискозометрический метод чины относительной вязкости определения изменения вязраствора за 1 мин при дейкости раствора натрий-карбокси.мети л целлюлозы ствии 1 мл неразведенного фильтрата культуральной жидкости

ются конидий в виде редких зеленых подушечек. Среда «е окрашивается.

Сусло-агар. Через четверо суток роста при ;.иаметр колоний 70 мм. Воздушный мице чий бесцветный, ирижатый, с хорошо выраженными концегггрическими окружностями.

Конидии не образуются. Среда окрашивается в желтый цвет.

Органическая среда Роулен-Тома с добавление.мЛ% кукурузного экстракта. Конидий ,0 образует. Среда не изменяет цвета.

Ломтики картофеля. Посев штрихом. Через 30 суток выращивания при 28°С колония зал() всю новерхаость ломтика. Воздушнь;- : миг,слий цушистый, желтый. Ковидиеобколичественного определения содержания целлюлоз в фильтратах культуральной жидкости 9 разование обильное. Субстрат интенсивно ок-5 рашен в ярко-желтый цвет. Желатииу не разжижает (через 30 суток инкубирования). Молоко пеитонизирует медленно. рН ереды 7,7-7,8.10 Нитраты восстанавливают к 30 суткам ийкубации. Крахмал гидролизует интенсивно. Отношение к источникам углерода. Глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, ксилозу, маннозу,15 рамнозу, сахарозу, глицерин ассимилирует. 10 Цитологические особенности штамма на синтетической среде Чапека. Набухание конидий происходит через 4-6 час инкубации, прорастание через 8-10 час инкубации, чаще с двух концов, иногда - с трех, Гифы длинные и короткие, сильно искривленные, ветвистые, интенсивно окрашенные, Конидиеносцы формируются к 24 час инкубации, ветвистые. Зрелые конидии образуются к 30 час инкубации. Лизис культуры через 72 час инкубации.