Способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты Советский патент 1976 года по МПК C07D501/18 A61K31/545 C12P35/02 

(54) СЛКХЮБ ПОЛУЧШШЯ 7- ШИНОДЕЗАЩТ(ЖСИЦЕФАЛОСПОРАНОВОЙ КИСЛОТЫ

е носителя используют целит, сипикагель, активиованный уголь, его количесгво при периодическом пособе работы составляет предпоггительно 5-15 вес.% от количества фильтрата культуры. Энзимую реаки 1ю проводят, как правило, на колонке, количество непрореапфовавшей 7 ациламинодезцетоксииефалоспорансвой кислоты в выходящей еакционной жидкости составляет обычно ,5-1,0 вес.%. Целевой прсоукт выделяют известным способом с выходом до 89%. Пример 1.

А. 20 л жидкой культуральной среды (рН 7,0), содержащей 1% полилептона, 1% дрожжевого экCTpaiaa и 0,5% х;юристого натрия, загружают в чашечный ферментатор на 30 л и стерилизуют в течение 20 мин паром при i20C. Затем в стерипьиых условиях переносят в зту культуральную фсау 200мл затравочной культуры Bacitlus megaterium B-400 FEPM-P N 4S, которую выращивают при 30 С R течение 24 час в культуральной среде указанного состава и ферментируют при 30° С в течение 48 час с азрацнсй и перемешиванием при расходо воздуха 20 л/мин (скорость мешалки ЗООсб/мин). По оксмчании ферментащш клетки удаляют с помощью иентр1н(уг -сепаратора Вестфа ЛИЯ N noHyHatoT 17,4 л фильтрата культуры.

Б. Фильтрат культуры упаривают до 1/3 объема при наружной температуре 30-35°С и в концентрат добавляют сульфкг аммония до достижения 80% насыщения. Вытвший осадок растворяют в дистиллированной аоде и обессоливают на колонке с сефадексом С-25. Обессоленный раствор вымораживают и получают 24,3 г стандартного энзимного продукта.

В. рН 10 л полученного фильтрата кулатуры Bacillus megaterium B-400 FEPM-P № 748 доводят до

7с помои ю уксусной кислоты. К фильтрату 1сультуры добавляют SOO г диатомитовой земли и полученную смесь перемеишвают в течение 30 мни.

8течение этого времени постоянно поддерживают рН 7. Затем реакоионну жидкость центрифугируют на цеятрнфуге корзинчатого типа, затем промывают водой.

П р и м е р 2. рН фильтрата культуры Bacillus meeaterlum В-400 FEPM-P N«748, полученной в пример Б, доводят до значения 7. К каждому литру фильтрата отдельно . добавляют по г. SO г цслита ( Супер Цел), активированного угля (фирмы Вако Джюцяки Ко, для хроматографии), СМ-целлюлоэиогоионообменника (фирмы Серва Ко, 0,52 мкг/г) и амберлита СС-50 (форма Н), полученные смеси перемешивает в течение 30 мин. В это время рН поддерживают около 7t затем каждый носитель выделяют фильтрованием, промывают водой и получают влажный носитель. Рассчитывают степень энзимной адсорбции для каждого носителя, принимая за адсорбцию энзима степень адсорбции целитом, при этом получают результаты, приведенные в табл. 1.

т а б л и ц а 1

Относительная степень адсорбции,%

100 100

уголь

100

81,2

П р и м е р 3. Целит с сорбированным диацилирующим энзимом (энзимный тнтр 1800 ед/г), полученный в гфнмере 2, промьшают буферным раствором0,01 М фосфата (рН 7,5), набивают в колонку, снабженную рубащкой (5 х 50 см), и промьшают в течение 1 час щ и определенной скорости этим же буферным раствором.

Наружную температуру колонки поддерживают

около 37 С. Затем через колонку пропускают 6 л | (5 мг/мл свободной кислоты) водного раствора натрий 7 - фенилацетамидодезацетоксицефалослораната прк ощхделенной скорости, вьгтекающую жидкость 4Чзк19(ошфуют на отдельные фракции

(количество каждой 4 акции 10,8мл).

рН 6,4л злюата доводят до б и упаривают до i/lO объема. Концентрат доводят до рН 3,7 с помощью 6 N н. соляной кислоты,1фи этом образующаяся 7-АДСК начинает выпадать в осадок. Для

завершения осаждения концентрат охлаждают льдом, осадок отфильтровывают, промывают небольщим количеством ледяной воды, хорощо промьшают ацегон и«1 и после суидкн получают 14,00 г белой 7-АДСК, т.ш1. 240-242С, выход 72,4%.

Этот продукт растворяют в водном растворе едкого натра (2,5), раствор обесцвечивают активированным углем, доводят рН до 3,7 с помощью 6 N н. соляной кислоты и охлаждают льдом для осаждення 7-АДСК. Затем 7-АДСК отфильтровывают, промывают небольщим количеством ледяной воды, 1фомывахп ацетоном и сущат, при этом получают 11,4 г очищенного продукта.

П р и м е р 4. Повторяют ;пример 3, но вместо целита с сорбированным деацилирующим

энзимом для получения 7-АДСК используют активированный уголь с сорбированным экзимсяи, СМ-целлюлозу с сорбированным знзимом и амберлит СС-50 с сорбированным энзимом. Получают

результаты, фиведеннЫе в табл. 2.

П р и м е р 5. Для получения культуры проводят выращивание, как в 1фимере 1. 1 л этой культуры переносят в резервуар для выращивания культуры на 250 л, в котором находится 200 л среды такого же состава в примере 1, в ведут вьфащквание при 30° С в течение 48 с. Для получения 350л культуры (фильтрата) используют 2 резервуара на 250 л. К фильтрату культуры до&1вляют 3,5 кг целита и смесь перемешивают 30 мин, поддерживая рН среды 7. Затем смесь дегидратируют ва центрифуге, остаток промывают водой и получают 5,2 кг влажного целита (энзимный титр 5000 ед/г). Этот целит помещают в поливинилхлоридную колонку размером 120x900 мм и через нее пропускают раствор (5 мг/мл) 7-фшилацетамидо. дезацетоксицефалосоорановой кислоты в фосфатном буферном растворе |0,05М рН 7,5), поддерживая температуру 37 С . Элхшршание заканчивают в течение 72 час, и получают всего 375 л элюата. К этому элюату добавляют 290л аиэтона, рН полученной смеси доводят до 4,0 6н. соляной кислотой, перемешивают в течение 30 1ян и оставляют на ночь для выпадения осад ка. Осадок отфильтровывают, промывают ааетоном и сушат, получают 1130,2 г кристаллов 7-АДСА (чистота 90,0%), выход 89,2%.

Формула изобретения

Gioco6 получения 7 - амннодезацетоксицефалоспорановой кислоты общей формулы

, СООН

отличающийся тем, что, с целью увеличений выхода целевого продукта, водорастворимую соль 7 - ащтаминодезацетоксицефалоспорансюой кислоты общей

T CO-NHv А

СООМ

где R - бензЕпьная шти феноксиметильная группа;

М - атом щелочного металла,

подвфгают контакту с фильтратом штамма Bacillus megaterium В-400 РЫМ-Р№ 748, продуцирующего эюим - аминогвдролазу ацетамица, причем указанный фильтрат адсорбировал на носителе.