(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕГАМИЦИНА
Изобретение относится к производству антибиотиков. Предлагаемый способ получения негамндина ранее в патентной и научно-техни ческой литературе не описан и заключает ся в том, что штамм5il eptoiTt fce& put peofuBCUS АТСС 2147О выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением .антибиотика. ШтаммSifsplomjсев puvpeoiuscua АТСС 2147О выделен из образца почвы, собранного в Миогизане префектура Гунма, хранится в Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 2147О и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиоло го-биохимическимИ свойствами. Культурально-морфологические признаки. Штамм образует хорошо разветвленный субстратный мицелий .под прямым направл нием к гибкому аэриальному мицелию без разветвления завитков и образования спиралей. Поверхность спор гладкая. Глицерин Чапека с агаром. При инкубации при 27 С культура цветом от светло-желтого до темно-желтовато-коричневого образует обильный мицелий светлосерого цвета, раствощмый пигмент цветом от коричневого до бледно-красновато-коричневого. Среда Краинского с глюкозой, аспарагином и агаром. Культура от желтоватокоричневого до темно-желтовато-коричневого цвета, образует мицелий цветом от желтовато-белого до светло-коричневатосерого - растворимый пигмент имеет слабцй коричневый цвет. Среда с малеатом кальция в агаром. Культура серовато-коричневого двета образует скудный мицелий цветом от серовато-белого до светло-серого, растворимый пигмент не образует. Пептоновый раствор, содержащий 1,0% нитрата натрия. Культура от б цветной до светло-желтовато-коричневого цвета
без аэриального мицелия, растворимый пигмент отсутствует или наблюдается небольдцое количество коричневого пигмента; слабое восстановление нитрата.
Картофельная среда. Морщинистая культ/ра цветом от светло-желтовато-коричне- s вого до желтовато-коричневого, позднее до темно-желтовато-коричневого и до чep ного,- отсутствует аэриальный мицелий, растворимый пигмент слабо-коричневого цвета,-10
Пластинка из крахмала с агаром. Культура цветом от светло-желтовато-коричневого до желтовато-коричневого, образует аэриальный мицелий цветом от желтоватобелого до светло-серого, растворимыйjj пигмент цветом от коричневатого до светло-красновато-коричневого.
Питательная среда с агаром. После инкубации при 37 G в течение 14-ти суток роста культуры не наблюдается. Пос- jo ле инкубации при 27 С культура светлокрасновато-коричневого цвета, не образует аэриального i мицелия и образуетсветло-красновато-коричневатьШ растворимый
пигмент.25
Среда Лоффлера с коагулированной сывороткой. После инкубаши при 37 С в течение 14-ти суток роста культуры не наблюдается.
Желатиновая среда. После инкубации ЗО при 2О°С культура от бесцветной до свет ло-желтовато-коричневой, не образует аэриального мицелия и образует растворимый пигмент цветом от коричневого дс темно-коричневого.35
Снятое молоко. После инкубации при 37 С- бесцветная культура не образует аэриального мицелия или растворимого пигмента.
Среда с тирозином и агаром. После ; 40 инкубациипри 27 С культура от бесцветной до серого или темно-коричневого цвета, образует тонкий аэриальный мицелий цветом от белого др серовато-белого. Физиолого-биохимические признаки..
Аэроб. Оптимум роста при 27 С. Гидролизует крахмал. . Разжи 1;а(ёт желатину. , Пептонизирует молоко.
,50
Отношение к углеводам Усваивает
глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, галактозу, глицерин, декстрин, крахмал. Не усваивает фруктозу, ксилозу, инозит, лактозу, раффинозу, рамнозу, инсулин,55
сорбит, арабинозу, салицин, дулышт.
Антагонистические свойства. Ингибирует pocTPseudloHto«c(S,Sa rtroKeEEo(, KCebsie Eq,StQpuyEococcu6,Proieue.
Конкретные примеры осуществления предлагаемого способа приведены ниже. Пример. 125 мл среды состаБду л
Глюкрза2,ОООО
Кралмал2,ОООО
Соевая мука2,0000
Экстракт дрожжей0,5000
Хлористый натрий0,25ОО
Карбонат кальция0,350О
Пентагидрат сульфата меди О,ООО5 Гептагидрат хлористого марганца0,ООО5
Гептагидрат сульфата цинка помещают в колбу емкостью 50О мл. Устанавливают рН 7,0 и стерилизуют смесь при 120 С в течение 20 мин. Затем в асептических условия; к этой среде прибавляют 2,5 мл 2-дневного бульона штамма АТСС 2147О.
Среда для затравочной культуры содержит, %:
Глюкоза1,ОООО
Крахмал1,ОООО
Мясной экстра.ктО,7500
Пептон0,750О
Хлористый натрий0,ЗООО
Гептагидрат сульфата
магния0,1000
Пентагидрат сульфата меди 0,0007 Гептагидрат сульфата двух- , валентногЪ железа0,0001
Гептагидрат хлорида марганца0,0008 Гептагидрат сульфата цинка 0,ОО02 Сбраживание ведут S суток при 27 С и при встряхивании со скоростью 130 колебаний в минуту. Этот бульон центрифугируют для отделения мицелия, и 6ОО мл фильтрата получают из шестидесяти склянок. Фильтрат содержит 35 мкг/мл негамицина. Фильтрат пропускают через колонку (диаметр 30 см) с 40О мл амберлита 1RC-50 {70%-ная натриевая форма) После промывания водой негамицин элюируют 2О%-ным водным аммиаком, Активную фракцию объемом 6ОО мл концентрируют при пониженном давлении и получают 144 мл концентрированного раствора {рН 9,4 8ОО мкг/мл). Концентрированный раствор пропускают через колонку (диаметр 16 мм) с 6О мл смолы Дауэкс 1X2 в гидроксильной форме. После промывания 2ОО мл воды негамицин элюируют 0,5 н. раствот ром UCff, После нейтрализации амберлитом (в гидроксильной форме) активную фракцию высушивают при пониженч ном давлении. Порошок-сырец гидрохлори56да негамицина весом 300 мг имеет 21% ную чистоту. Порошок-сырец (3UO мг) гидрохлорица негамицина растворяют в Ю мл воды раствор пропускают через колонку (циаметр 16 мм) с 6О мл амберлита СС 50 (в аммониевой форме) и промывают дистиллированной водой. Вытекающий раст вор отбирают фракциями объемом по 10 м Активное вещество находится во фракциях 57-96, Из фракции 57-84 получают 25 мг (чистота 68 мкг/мг) светло-желтоватого порощка негамицина, из фракции 75-85 - 20 мГ бесцветного порощка гчис того негамицина, из фракций 86-96 19 мг негамицина (чистота 91О мкг/мл П р и м е р 2, 130 л среды состава, Глюкоза3,000 Крахмал1,0000 Соевая мука2,ОООО Сухие дрожжиO,5OOU Карбонат кальцияO,350U Пентагидрат сульфата меди 0,ООО5 Гептагидрат хлорида мар- О,0005 ганца Гептагидрат сульфата цинка О,ОО05 помещают в изготовленный из нержавеющей стали аппарат для ферментации емкостью 2ООмл, стерилиауютЗО мин при 120 С, инокулируют васептических условиях 1,2 л культурироранного бульона штамма АТСС 2147О, перемещивают со скоростью 2UO об/мин и/аЗрируют 25 л воздуха в 1 мин в течение всего периода ферментации - ИЗ ч. Температуру поддерживают 27°С. рН НО л бульона
СНа-СН - еНз-Сн-СНа - С-NH-ir-Си, - ioOH
I.IIиI
NHj ОНNHgОСНз
- -
+ 2,5 (с 2,Н20).
Максимума поглощения в УФ-спектре в пределах 22О-4ОО ммк не имеет.
Максимальные частоты поглощения в ИК-спект|)ё; (KB«t) :.343U, 3200, SQS, 295О, 166О, 159О, 14О5, 1320, 114 1О50, 97О, 89О, 82О, 72О
Белый порошок, хорошо растворим; в воде, не растворим в метаноле, этаноле, эфирах, бензоле.
Дает положительную реакцию на нингидрин, реактив Ридона- Смита и отрицательную реакцию на антрон и реактив Сакагучи.
45 Амфотерен, обладает еильноосиовными и слабокислотными свойствами.
Негамицин ингибирует рост грамотрицательных и грамположительных организмрв. При определении бактерицидного эффекта с использованием агара с мясным экстрактом и пептоном (чайную ложку культуры, выросшей за 20 ч в питательной среде, размазывают в виде полоски) ингибируются следующие организмы при следующих концентрациях (величины в скобках показывают концентрации при частичном ингибировании), мкг/мл: 4 (рН 7,4, 63 мкг/мл) устанавливают 4,9 при помощи 1 л 6 н, НСЕ , а загем профильтровывают через 8 кг диатомовой земли. Включая воду, использованную для промывания фильтра, получают в общей сложности 117 л фильтрата, который пропускают через колонку с 6,5 л амберлита 1RC-50 (7О%-ная аммонийная форма), После промывания водой негамицин элюируют 0,5 н, раствором аммиака, активный элюат объемом 3 л концентрируют до 495 мл (3520 мкхУглл) при пониженном давлении; Концентрат пропускают через колонку с Дауэксом 1X2 (гидрбксильная форма), промывают 35О мл воды и элюируют негамицин 0,5 н, НСЕ , 18О мл активного элюата нейтрализуют 3 н, аммиаком, сущат и получают 5,5 г желтоватокоричневого порошка негамицина-сырца (чистота 294 мкг/мг). Общий выход 23,4%, 3,4 г порощка негамицина 29 4%-ной чистоты растворяют в 22 мл воды, устанавливают рН 8,8 и вводят раствор в колонку ({щаметр 26 мм), заполненную смолой амберлит CQ -5О в аммонийной форме. После промывания 500 мл воды через колонку пропускают 0,1%-ный аммиак, элюат отбирают фракциями по 20 мл, Негамицин обнаруживают во фракциях 69-81, Из фракций 69-73 получают 233 мг (90%-ная чистота) светло-желтоватого порощка кегамициьа, из фракций 74-77 получают 383 мг чистого негамицина, из фракций 78-81 - 395 мг. Антибиотик-негамицин, обладающий антибактериальной активностью, имеет структурную формулу После выращен бавпяют ку нанос роста на трации, прийеден 7 6224148 5iaplfyHococcus oruheus 209p50,00 6ioiphy ococcu6 aui«eus 19312,50 (6,12) , . SiaphyBococcue aupeus Смита50,oo Sarcittoi Putecii PC3-IOOJ12,5 (1,56) SdciEBus eubiiHis ,-Б ,0 (12,5) E.coEi XI23,12 (1,56) H.CoEi NtJHj12,50 (ЗД2) 6h{geg a i2emet i12,5O SaKmotteEKo iyphosa3,12 KEebsJeEHa p -euttToiiu6 Pea 602112,50 (6,25) Sfiraiia Hioficescetts12,5O (6,25) Pt oteue vuHgar s 0X196,25 Pmteus reUgciri 6A31112,50(6,25) Pseudomortcxs aenu irtoeor V2325,00(12,50) Peeudoittonas lEuovescsKS6,25 (3,12) Mycobacieitiuttt swe iaius b07100,00 ого,,, как 2О-часоБую культуру,В 0,5%-ном пептоновом агаре ингибив питательном льоне, раз- рующий эффект выражен сильнее, чем в 1ООО раз и одну чайную лож- питательном агаре, и ингибируются слев виде полоски, ингибирование 35 дующие организмы - при следующих ко, юдается при половинной концен- центрациях (величины в скобках даюттая те концентрации, которые ся длячастичного ингибирования), выше. мгк/мл: . 5. 209р1,56 S.Euieof PCtJ-lOOl5,00(2,50) B.subiigis K-i21,56 B. .B 9-e12,50 E.eo8i N3HJ1.5 5Л2ехнег 3,12 к.рмеитонше РСЗ 6026,25(3,12) 6.-t)/phosoi 0,78 Pit.j eiigari CN311i.S6 S-mar-cesceMS12,50 (3,12) Pa.aerugonosa Ps.aerujirtoeoi №4Ь M.segmoftis 607 Негашцин не ингибирует альбиканов при концентрации 100 мкг/мл, ингибирую щий эффект его не снижается в присутствии сыворотки; например, Е. Со ингибй-г руетоя при помощи ЗД2 мкг/мл негамици на во всех средах, содержаищх сыворотку в концентрации 0,5, 10, 20, 4О%. Негамицин оказывает более сильное бактерицидное влияние при щелочных величинах рН. Например, и 1гибирующая концентрация против Е.Со в О,5%-ном пептоне в воде.при различных величинах рН следующая (в скобках даны концентрации для частичного ингибирования), мкг/м рН5,0-12.5.(ЗД2); рН6,0-12,5 (3,12); рН 7,0-3,12 (1,56); рН 8,0-1,56 (0,f8) рН 9,0-1,56 (0.78). При методе с цилиндрической пластинкой с использованием О,5%-ного пептонового агара и E.coEi К 12 концентрация негамицина в 25 мкг/мл дает следующие диаметры ингибированных участков при следующих величинах рН: 6,О-16мм, 7,0-20 MMV 8,0-21 мм. Негамицин обладает низкой токсичностью. При внутривенном впрыскивании, до61410 3,12 (1,56) 50,ОО зы в 4ОО мг/кг мышь погибает. Токсичных признаков не обнаруживается при ежедневном интраперитониальном введений 200 мг/кг мыши в течение 30-ти дней. Задержанной токсичности также не наблк дается. При внутримышечном введении 5 О мг/кг кроликам обнаруживается высокая концентрация в крови - 1ОО мкг/млчерез 1ч после введения и 80% выводится с мочей за 24 ч, что показывает высокую концентрацию препарата в моче, наприме|5, 4480 мкг/мл в моче, взятой через 1-2 ч после инъекции. орм/ла изобретения Способ получения негамицина, отличающийся тем, что щтамм Streptomycee pui peofuscue АТСС 21470 выращивают в аэробных у словиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и мине, альные соли, с последукшим выделением елевого продукта.
