Способ выделения и очистки -амилазы из поджелудочной железы Советский патент 1976 года по МПК C07G7/26 

1

Изобретение относится к нроизводству ферментов, а именно к способам выделения из поджелудочной железы L-амилазы и ее очистки.

Известен способ выделения L-амилазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота с последующей очисткой. Он заключается в том, что измельченную и обезвол енную железу обрабатывают раствором, содержащим ионы Са, в полученный раствор добавляют ацетон и осадок отделяют центрифугированием. Затем осадок суспендируют в минимальном количестве воды и диализуют против проточной воды.

Отдиализованный раствор осветляют путем центрифугирования и проводят кристаллизацию.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение чистоты L-амилазы за счет того, что диализ раствора осуществляют против фосфатного буфера, полученный диализат дополнительно обессоливают на анионите в рН-форме в статических условиях, а затем обрабатывают кизельгуром.

Кизельгур удаляют фильтрацией, а полученный раствор лиофильно высушивают.

Из растворов, содержащих ионы Са++, для обработки поджелудочной железы используют ацетат кальция, расходуя его при соотношении 1 : 3 к весу ноджелудочной железы.

Пример. Мороженую свиную панкреазу измельчают на волчке с диаметром отверстий решетки 2 мм. Измельченную железу порциями загружают в емкость с охлажденным ацетоном в соотношении 1 : 5.

Операции обезжиривания и обезвоживания ведут при нулевой температуре в течение шести часов, осуществляя каждый час перемешивание по 15 мин. Осадок выдерживают

3 - 4ч, после чего сифонируют ацетон. Железу заливают новой порцией ацетона в соотношении 1 : 3. Такую обработку noBTOpsnoT трижды. Обезжиренную железу отнрессовывают на

гидравлическом прессе и сушат тонким слоем цод вакуумом при 18 - 20° С. Высушенную железу измельчают на шаровой мельнице. В итоге получают 25 г сухой панкреазы. Затем следует непосредственное выделение L-амилазы и ее очистка. Для этого полученные 25 г сухой железы экстрагируют 0,02 Н раствором ацетата кальция в соотношении 1 : 10 в течение 16 ч при температуре от О до 3° С. Остаток отделяют фильтрованием и суспендируют в 0,02 Н. растворе ацетата кальция (в соотношении 1 : 3 к весу сырья) и подвергают повторной экстракции в течение 2 ч при 3° С. Полученный экстракт фильтруют, остаток отпрессовывают на гидравлическом прессе.

Экстракты объединяют и фильтруют через сукно при 3° С. Из полученного фильтрата осаждают балластные белки, охлаждают ацетоном, конечная концентрация которого равна 47%. После отделения балластных веществ доводят концентрацию ацетона до 69%. Выаавший осадок, содержащий амилазу, отделяют на центрифуге при 0° С и промывают 90%ным спиртом, удаляя ацетон. Осадок амилазы растворяют в воде при соотношении 1 : 2, доводя рН до 8,0 путем добавления 0,01 н раствора едкого натрия, а затем диализуют против фосфатного буфера в течение 8 ч при 4 - 5° С.

Диализат отделяют от выпавшего осадка и обессоливают на анионите ЭДЭ-10П в ОНформе в статических условиях при концентрации смолы 10 г/л. После отделения смолы фильтрацией под вакуумом раствор обрабатывают кизельгуром из расчета 8 г/л. Затем кизельгур отделяют и полученный прозрачный раствор амилазы фильтруют на асбесто-целлюлозных фильтрах. Отфильтрованный раствор замораживают при -60° С и лиофильно высушивают при конечной температуре в продукте +25° С. В результате получают 350 - 400 г сухого препарата с активностью 5 - 7 тыс. ед/кг. При хранении в комнатных условиях в течение 3 лет он практически не теряет активности. Такой препарат амилазы может найти при.менение не только для проведения научно-исследовательских работ, но и для медицинских целей.

Формула изобретения

1. Способ выделения и очистки L-амилазы из поджелудочной железы, предусматривающий экстракцию измельченной и обезвоженной поджелудочНой железы раствором, содержащим ионы Са, осаждение ее из экстракта, например, ацетоном, отделение полученного осадка, растворение его с последующим

диализом раствора, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты L-амилазы, диализ осуществляют против фосфатного буфера, полученный диализат дополнительно обессоливают на анионите в рН-форме в статических условиях, а затем обрабатывают кизельгуром, удаляют последний, например, фильтрацией и полученный раствор лиофильно высушивают. 2. Способ но н. 1, отличающийся тем,

что из растворов, содержащих ионы Са, используют ацетат кальция, при этом его вводят при соотношении 1 : 3 к весу поджелудочной железы.