Способ получения антибиотика Советский патент 1977 года по МПК C12D9/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

от беловатого цо сероватого. Растворивши пигмент отсутствует в течение двух недель. Через месяц цвет зерановаго - серьзй, количестзо незначитеньноеГллщзрино-аскарапаювьш агар-агер (W-3).

субстратный г. -коричневато- кеятый с нерег лкр1Э ьс5 сдздаак зеленоватого цвзга. ВоздушыыЭ ьаш.елш бело-сероватый, светло-сероваткй. S Bimie умеренное. Растворимый яигмент Kopi 4J3sso-cepbJU с небольшим количеством зеленоватого и серо-зеленого,

Агар-агар с малатом калыщя К|)аинского.

Обратная сторона колоний светло-желто-сероватая. ВоздушньЕ мицелий беловатый, светло-серый. Растворимый пигмент сероватый или от« утствует.

Агар-агар с Т11розином.

Обратная сторона колоний желто-коричневая. Воздушньй ьшцелий зкелтоватый, умеренно развитый. Растворилйэш ша-мент желто-кор:пневый.

Агар-агаре крахмалом (W-11).

Обратная сторона колоний от зеленовато-серой до темно-зелено-коритаевого . Воздушный мицелий беловатьш и серьй, yt.iepeHHO развитьш. 1 створимый пигмент беповаш-зеленый, зеленовато-серый.

Агар-агар с крахмалом Придам. Обратная сторона колоний серовато-желтая. Воздушный мицелий светло-серый, достато шо хорошо развитый. Растворимый гшгмент отсутствует. Гидролиз крахмала средний.

Синтетический агар/агар Чапека с глицерином.

Обрат ая сторона колоний светло-серая и желтокоричневая. Окрашивается з зеленовато-коричневый цвет в нроцессе образования растворимого пигмента зеленого цвета. Воздушньш мицелий беловатый и серый. Растворимый пигмент светло-желтый, кор1чневый. При добавлении к среде земли пигмент по мере старения становится серовато-коршшевым и темно-зелено-коричневым, почти черным.

Среда на картофеле (W-27).

Субстратный мицелий зеленовато-коричнево-желтого и темно-зеленого цвета по мере старения культуры - черно-коричневого цвета. Воздуш- ный мивдлю от беловатого до светло-серого, развитие умеренное. Образование растворимого пигмента запоздалое, обильное, черно-зеленого цвета с переходом в зеленоватый, распространяется по всей поверхности картофеля.

129 ный 1ШСТЫЙ желатин.

Воздушный лшцелий ст беловатого до сероватого цвета, развитие умеренное, { творимый пигмент образуется через две недели. Через месяц желтовато-серого цвета.

Питательная среда с нитратом.

Беловатое кольцо на поверхности . Воздушньй мицелий беловатый, развитие очень медпенное. Растворимый пигмент отсутствует.

Глюкозо-нитратная среда.

На позерхностн сре;цл легкое кольцо и пленка от серовато-белого до светло-желтого цвета, развитие умеренное. Воздушный мицелий отсутствует или беловатого цвета (следы). Растворимый пигмент бледао-ядалпгьш.

Синтетическая среда Чапека с целлюлозой. Воздуышын мицелий серый, хорошо развитый по всей поверхности бумаги, погр женной в среду Снятое молоко.

а)при температуре iZe С - хорошо развитое кольцо бледно-желтоватого цвета. Воздушный мицелий отсутствует либо наблюдаются следы беловатого цвета;

б)при температуре 37° С - среднеразвитое кольцо от светло-желтого до светло-желто-коричневого цвета. Воздушный мицелий отсутствует, либо следы беловатого цвета.

Желатин умеренно превращает в жидкое состояние.

Молоко медленно пептонизируется с небольшой коагулящ1ей при 37° С.

Крахмал быстро гидролизуется.

Реакция нитратов положительная.

Сероводород не образует.

Тирозин и малат кальция растворяет хорошо.

Оптимальная температура роста штамма 25-28° С.

Способ получения антибиотика осуществляют следующим образом.

Культуру Streptomyces vifidans NRRL 3687 выращивают в глубинных условиях в, ферментадаонном аэробном процессе на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли и стимуляторы роста.

В качестве источника углерода можно использовать глюкозу, сахарозу, лактозу, декстрины, крахмал, сахарную патоку или органические кислоты: молочную, лимонную, винную.

В качестве истошика азота могут быть применены нитраты, минеральные и органические г,оли аммония, мочевины, аминокислот, а также казеин, молочный альбумин, соевая мука, мясной зкстракт, дрожхш, растворимые дистилляты и другие.

Из неорганических солей питательная среда может содержать щелочные или щелочноземельные фосфаты, карбонаты кальция шш магния, а также активаторы роста - соли цинка, кобальта, х(елеза, меди, марганца.

Ферментащио проводят при температуре 25-28° С, рН среды 6,5-7,5 и скорость азрацгш 0,3-2 л/л мин. Максимальный выход продукта через 4-7 дней культивирования.

Антибиотик нз культуральной жидкости выделяют известными способами с учетом его химических, физических и биологических свойств.

Активность антибиотика определяют методом диффузии, используя Bacillus в качестве тест-оргашвма,

Антибиотик 11,837. R. R. является сильной кислотоГдаейтральный зквиваленткоторой 600 ,1).

Элементарный анализ. %: С Н О 39,2; .

Молекулярный вес выше 5000. Физические свойа;тва.

Аморфный бельш дорошох разлагается при тевйнературе 160 С. Инфракрасный шекхр антнбеотккл в бро&шстом представлен на чертеже, на котором на оси абсцисс (нижняя шкала) взнесена с одной гторси1ы длина волн, выраженная е макронах, fi с другой стороны (верхняя шкала) щксло волн в сантиметрах ;,, а на оси ординат передача Б процентах.

Бак1ериостатическую активность антибиотика 11.8.37.П.П. определяют методом разжижения.

Результаты различных определений представлены в таблице, где минимальные бактериостатически; концентрации выражены в микрограммах субстанции на 1 см испытуемой среды. Aismбиотик обладает большой продолжителшостьдействия и слабой токсичностью.

Пример. Ферментер емкосгъю 170 л разгружают средой следующего состава (в кг): Замоченное зерно4,8

Водная глюкоза2,4

Хлористый натрий0,6

Сульфат магния0,12

Вода, лдо 100

После установления рН средал 7,15 575 см концентрированного натрия (d - 1,33) добавляют 0,6 кг карбонат; кальция.

Питательную среду стер51лизуют паром при температуре 122° С в течение 40 мин. После охлаждения объем среды составляет 120 л, а рН 7,15. Среду засевают 200 мл культуры Streptomyces viridans NRRL 3687 и инкубируют при температуре 26°С в течение 28 ч при непрерьшном перемешивании и аэрашш стерильным воздухом.

Ферментацию осуществляют в ферментере объемом 350 л на ферментаизяонной среде следующего состаза (в кг): Соевая мука 8,0 Растворимые дистилляты 1,0 Крахмал 3,0 Карбонат кальция 2,0 Хлорисгый натрий 2,0 Хлористый водный кобальт (6HjO) 4,0 Соевое масло, л 3,0 Вода, л 180 рН среды 7,05. Среду стерилизуют паром при температуре 122° С в течение 40 мин.-После охлаждения объем среды 200 л, рН 7,15.

Ферментационную среду засевают 20 л, подготовленного описанным вьпие образом инокулята.

Ферментацию ведут при температуре 26-27° С в течение 138 ч при перемешивании и аэраиии стерильным воздухом, рН среды 7,9, объем ферментационной массы 180 л.

Концентрация антибиотика в ферментационной массе 4515 л/см.

П р и м е р 2. Фермштацию осуществляют в ферментере емкостью 350 л на ферментационной среде следующего состава:

Намоченное зерно, кг6

Крахмал, кг2

Соевое масло, л3

Хлористый водный кобальт (6Hi О), г 4 Вода, л175

рН среда устанавливают 5 380 см концентрироватшого натрия (d-133) и добавляют 1 кг карбоната кальция. Среду стерилизуют паром при температуре 122° С в течение 40 мин. После охлаждения к среде добавляют стерильные 0,4 кг сульфата аммония и 5 л воды. рН среды 6,8, объем 200 л.

Д1элее засевают 20 л инокулята, подго товленного, как О1шсано в примере 1.

рментацшо осуществляют при температуре 26-27° С в течение 144 ч при перемешившши и аэрации стерильным воздухом, рН ферментационной массы 8,4, концентрация антибиотика -3550 я/см

Примерзав 200 л ферментационной среды с рН 8,4, имеющей титр 2855 л/см j устанавливают рН 3 SN раствором соляной кислоты в резервуаре, снабженном перемешивающим устройством. Затем добавляют 12 кг вспомогательного средства фильтрации. Смесь фильтруют через фильтр-пресс, а остаток фильтрации промывают 60 л водоироводной воды. Фильтрат и промьшную воду выбрасывают как отходы. Остаток фильтрации взбалтывают в 150 л смеси бутанола и метанола (2:1); рН смеси доводят до 6 10 н, раствором натрия. Перемешивание ведут в течение 30 шн, затем смесь фильтруют через фильтр-пресс. Фильтрат собирают, а остаток промывают 30 л смеси бутанола и метанола.

185 л промывочной воды и фильтрата имеет титр 2075 л/см. Спирговьш фильтрат концентрируют под давлением 20 мм рт.ст при температуре 35° С до объема 2 л.

Выпавший в осадок антибиотик отделяют фильтрованием, промывают ацетоном и высушивают в сушильном шкафу под вакуумом (5 мм рт.ст.).

Получают 254 г зелено-серого вешества, имеюидего титр 1025 л/мг.

П р и м е р 4. 375 л ферментационной массы с рН 7,9 пропускают через сито для удаления крупных частиц, рН доводят до 7,5 н. раствором соляной кислоты при перемешивании. Затем добавляют 22,5 л смолы J30WEX 1x2 в хлористом цикле, перемешивают 2 ч, после чего смесь пропускают через вибросито. Смола задерживается на сите, а среду выбрасывают. Затем смолу загружают в колонну и последовательно промывают 50 л водного раствора хлористого натрия и 10 л воды. Промытую смолу обезвож1П5ают, пропуская 20 л метанола. Адсорбирова}шое вещество извлекают раствором метанола с 20% воды и 2,8% хлористого аммония. Элюаты концентрируют под давлением 20 мм рт.ст до объема 3 л. Концентрированный раствор с титром 92.950 л/см и уделышм весом 1,057 диализируют в течение 48 ч против дистиллированной воды аш помощи пленки типа даллофан. Объем раствора 4,7 л, удельный вес 1,025. Раствор концентрируют под давлением .э мм рт, ст. ц,о1 300 см, затем лиофилизируют. Получают 48 г неочищенного вещества с титром 6530 л/мг. П р и м е р 5. 250 г неочищенного антибиотика, полученного по примеру 3, растворяют в 4 л воды при рН 8. Водный раствор фильтруют, пропускают через колонну, содержащую 2,7 л ионообме1шой смолы до W ЕХ 1x2 в хлористом инкле; обработаш{мо воду удадоюх. Смолу промьшают 2J л воды, затем 2,5 л смеси метанол-вод (80:20 по объему). Ашибиотик элюирукпг 10 л смеси метанол-вода, содержаи ей 7,5 г/л хлористого калия. Элюат концентрируют до 400 см под давлением 20 мм рт.ст. ПРИ температуре 40° С. Концентрат даализируют против дастиллированной воды в течение 24 ч посредством целлюлозной пйенки для удаления минеральных солей и органических примесей, 650 см диализированного раствора концентрируют поадавлением 20 ммрт. ст. до объема 125 см . Антибиотик осаждают Т1утем дооавленйя 20 объемов смеси эфир-ацетон-изопропанол (10 : 10 : ;10). После фильтрации, промывки в ацетоне и высуиишання в течение ночи при температуре 35° С под давлением 2 мм рт.ст. получают 8,25 г светло-серого порошка с титром 24-600 и/мг.

Staphylococcus aureus, souche 209Р-АТСС 6538 Р

f , ,

souche 133 (Incti tut Pasteur)

)iJl

souche Smith

Sarcina Lutea - ATCC 9341

Streptococcus fsscalis - ATCC 9790

viridans - (Institut Pasteur)

- pyogenes hemolyticus (souche Dig 7, Institut Pasteur)

Neisseriagonorrhaeae (A50 - tnsxitut Pasteur) DiplocQCCus pneumoniae (souche Til, Institut Pasteur)

Bacillus subtilis- ATCC6633 - - cereus /- ATCC 6630

Mycobacterium species - ATCC 607

- - - - para-srnegmatis (A75 - Lausanne)

EscherichJa coli - ATCC 9637

Shigetia dysentariae - Shiga L (Institut Pasteur)

Salmonella paratyprfil A (Lacasse, Institut Pasteur)

- - - schottnuielleri ( paratnypftifB) Fougenc (Institut Pasteur)

0,15 0,15

0,35 150

50 0,6

0,005 l,2b

0,03

3 0,03

35 65 35 40 55

Proteus vulgar is - A 244

Klebsiella pneumoniae - ATCC 10.031.

Pseudomonas aeruginosa (souche Bass - jgstitut Pasteur/

Bruceila bronchiseptica (CN-387-Welicome

abortusbovis 8 19 Pasteuretia multocida (A 125, Institut Pasteur) Tr oneme de Reiter Формула изобретения Соособ получения антибиотика, отличающ н и с я тем, что культуру Streptomyces viridans35 NRRL 3687 выращивают в аэробных условиях на шо :зооо 2000

61520

10 Продолжение таблицы

165 60

40

Institut)

.0 питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, с последующим выделением и очисткой целевого продукта известными приемами. 700 см woo 300