Способ получения оксидазы д-аминокислот Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 C07G7/26 

I

Изобретение относится к способам получения очашенных ферментов, а именно оксидазы Д-аминокислот (К.Ф. 1.4.3.3.), которая используется в биохимических исследованиях при анализе аминокислот,

Известен способ получения оксидазы Д минокислот из животного сырья, включающий гомогенизацию сырья, экстракцию гомогенизата буферньп раствором, очистку экст«ракта- бензойной кислотой, разрушение комплекса бензойная кислота -фермент, освобождение от балластных белков и вьщеление фермента l .

С целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса по предлагаемому способу используют бензойную кислоту, ковалентно связанную с водонерастворимой матрйдей-силохромом С-8О посредством N укцинил- у -аминопропилтриэтоксисиланахи очистку осуществляют при рН 7,8-г

еЖ.

При этом освобождение от балластных белков проводят раствором хлористого натрия в буферном растворе.

Пример 1. Исходное сырье -25 г

|коры свинных почек гомогенизируют, Гомоге- нат экстрагируют 0,02 М пирофосфатным буферным раствором (рН 8,3).Нерастворимые примеси отделяют центрифугированием (1ч, 1000 g ). После этого 50 мл полученного Iэкстрак с общей активностью оксидазы D -аминокислот 234 Е и специфической активностью 0,60 Е/мг пропускают через хроматографическую колонну, наполненную 25 г сорбента, представляющего бензойную кислоту, ковалентно связанную с аэросилок(-сипох1ррмом С-80 посредством

N -сукцинил- у -аминопропилтриэтоксисиланаиуравдовешвннуюО,02 М пирофос- фатным буферным раствором (рН 8,3) со скоростью 15 мл/ч. Далее сорбент отмывают от примесей 200 мл 0,02 М пирофосфатного буферного раствора (рН 8,3), содержщего 1 М хлористого натрия, а затем дистиллированной водой.

Десорбций адсорбированного фермента осуществляют пропусканием через колонну 50 мл 0,5 М раствора . -аланина.

Чистоту полученного ферментного препарата определяют диском-электрофорезом на

7,5%-ном полиакриламидном геле. В результате получают одну зону, что свидетельствует о гомогенности препарата.

Общая активность полученной оксидазы

В -аминокислот 230 Е. Специфическая активность 312 Е/мг. Выход 98%.

Пример 2. Исходное сырье -. 15 г коры свиных почек гомогенизируют. Гомогенат экстрагируют 0,02 М пирофосфатным бубуферным раствором (рН 8,3). Нераство()имые примеси отделяют центрифугированием {1 ч. 1000 о ). После чего 30 мл полученного экстракта с общей активностью оксидаэы В -аминокислот 139 Е и специфической активностью 0,55 Е/мг пропуск ют через термостатированную (2 С) хроматографическую колонну, наполненную. 20 г сорбента, представляющего бензойную кисл л х - -поту, ковалентнр связанную с а росилом-си, лохромом С-8О посредством Н -сукдинил- тг -аминопропнлтриэтоксисилана. и уравнивещенн7юЮ 02 М пирофосфатным буферным раствором (рН 8,3), со скоростью .. 15 мл/ч.. Далее сорбент отмывают от примесей 200 мл 0,02 М пирофосфатного бу-. ферного раствора (рН 8,3), содержащего 1 М .хлористого натрия, и затем дистиллированной водой. Десорбцию адсорбированнога фермента осуществляют пропусканием i через колонну ЗО мл 0,5 М раствора В,Lал&ннна. Общая активность гомогенного ферментного препарата138 Е. Специфическая активность ЗО9 Е/мг. Вькод 97%.

Формула изобретения

1. Способ получения оксидазы D -аминокислот из животного сырья, включающий гомогенизацию сырья, экстракцию гомогенизата буферным раствором, очистку экстракта бензойной кислотой, разрушение комплекса бензойная кислота -фермент освобождение от балластных белков и вьщеление фермента, отличающийся тем, что. с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, используют бензойную кислоту, ковалентно связанную с водонерастворимой матрицей -силохромом С-80 посредством N -сукцинил- у -аминопропилтриэтоксисиланом и очистку осуществляют при рН 7,8-8,9. 2. Способ по п. 1, отличающийс я тем, что освобождение от балластных белков проводят раствором .хлористого натрия в буферном растворе. Источники информации,, принятые во внимание при экспертизе: 4PE.rMnibv,y.masse«/ D-Amiiio Acid from ри Kidtiei/. Btochemicaf Pfeflorottpm-N-J, О/лг k «-IMAi/ 11 j «i«tU 4««t f f%9 Die A МП / л Л««. kl 1 U7idoM,S./dtiei(,,g.waeij,i 1968, V. 12, j J.. л« i:. лл л t Л .«,..i..«.e.i л f p. 29-41.