Способ получения пепстатинов Советский патент 1978 года по МПК C12D13/06 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПСТАТИНОВ

эфиры пепстатина и новые пепстатины содержатся в отношении 1:1. Пепстатины В и С перекристаллизовывают из метанола и выпавшие кристаллы отфильтровывают . Маточный раствор почти не содержит метилового эфира пепстатина и новые пепстатины выкристаллизовывают из этого маточного раствора в виде тонких игл.

Щелочные соли новых пепстатинов, например полученны й в виде натриевой соли пепстатин В, представляет собой аморфный порошок, который п5№витс с разложением при 250-255 0, обнаруживает ингибированиепепсина (LDjg ) при 0,05 7Г Он в 10 раз лучше (00 мг/мл) растворяется в метаноле, чем исходный. Он растворим в водном бутаноле, этаноле, .изопропиловом спирте, диметилформамиде, диметилсуль фоксиде, уксусной кислоте, пиридине, слегка растворим в водном ацетоне, трудно растворим в безводном ацетоне безводном бутаноле, хлороформе, бензоле, эфире и воде.

Пример I. Штаммом StVeptomvces iestacens,образующим пепстатин заражают стерильную среду, состава, вес.%:

Глюкоза5,5

Соевое масло 2

Снятое молоко 4,5

Казеин5

0,15

К,НРО, Nace

0,35

Ag-SQ47H20 0,15(рн « 6.45)

в 2900 л объема и инкубируют 112 ч при 23-24°С при аэрации и перемешивании . Культуральная жидкость содержит антипепсинное вещество, эквивалентное 2260/у мл пепстаткна. При помощи разбавленной серной кислоты рН жидкости доводят до 2,5 и добавляют 3600 л метанола. Затем жидкость перемешивают 40 мин при температуре 15-20с, добавляют 4% вспомогательного порошка для фильтрования, отфильтровывгиот и прО1 2з1вают. При помощи щелочи рН доводят до 10, метанол испаряют в-вакууме и получают 1900 л водного «устатка. К этому остатку добавляют 800 л н -бутанола и рН смеси доводят до 7,0. После перемешивания в течение 30 мин при 20С отделяют 960 rfбутанольного экстракта. Затем рН бутанольного экстракта доводят до 3,0 и концентрированием в вакууме получают 55 л концентрированного сиропа. Этот сироп по каплям X при перемешивании добавляют в течение 60 мин а 800 л воды и образующийся осадок отфильтровывают.. Осс1док про «лвают водой,лйофилизируют и получают 7990 г желтого, неочищенного порошка новых пепстатинов. Антипепсинное вещество, эквивгилентное пепстатину, составля/1О 64% порсиака,

6080 г полученного неочищенного порошка растворяют в 33 л метанола и для обесцвечивания добавляют 1,25 кг активированного угля. К 38 л этого обесцвеченного метанольного раствора добавляют 125 мл концентрированной серной кислоты и перемешивают 2,5 ч при 60°С. Реакционную смесь нейтрализуют добавлением 0,63 л триэтиламина, перемешивают 120 мин при 50-60 0 и получают кристаллический порошок. После проьвлвки и сушки этого порошка в вакууме получают 3230 г метиловых эфиров нового пепстатина, имеющего антипепсинную активность ( LIX ) при 0,056 Т . Он плавится с разложением при 250-251° С, -90 (С 1,0, уксусная кислота). Этот порошок содержит более 80% метилового эфира пепстатина В ( R 0,39 по данным хроматографии в тонком слое).

П р им ер 2. 3100 г нового метилового эфира пепстатина, полученного в примере 1, ра.створяют в 130 л . 2 н.НаОН 90% метанола при и омыляют 2 ч. Реакционную смесь концентрируют в вакууме для испарения метанола и получают грязевидный концентрат. Концентрат растворяют в 20мп воды, насьиценной н -бутанолом, добавляют 15л воды и с помощью разбавленной фурфуриловой кислоты рН доводят до 3,0. После 20-минутного перемешивания, 18 л верхнего бутанольного слоя по каплям выливают в 270 л воды. Образовавшийся осадок после 60-минутhoro перемешивания отфильтровывают и проливают водой. Промытый осадок высушивают в вакууме и получают 2500 г Целого порошка. Этот порсяиок плав11тся с разложением при 205-210°С .-84° (,0 - метанол). LDgo (50%) ингибитиррвание по отношению к пепсину было 0,055Х. Оогласно кривой титровани на 700 мг порошка расходовалось 9,7 м 0,1 н. Not ОН.

Пример 3. 100 г метиловых эфиров нового пепстатина, полученного в примере 1, растворяют в 4 л абсолютного метанола и обесцвечивают 20 г активированного угля. Метанольный раствор оставляют стоять на ночь и получают сперва 24 г белых кристаллов. 4,2 л метанольного маточного раствора концентрируют до 1,3 л и осаждают. Этот осадок кристаллизуют после 60 ми перемешивания при 60 С. Повторная кристаллиз ция через 12 ч дает еще 5,5 г вторичных белых кристаллов. Эти кристаллы растворяют в 1,5 г горячего метанола и обрабатывают активированным углем. Метанольный раствор оставляют стсять на ночь и получают еще 12,0 г белых кристаллов.

Указанные кристаллы имеют следующие физико-химические свойства. Кристаллы после первой кристалли зации: т. пл. 250-251°С (разложение), ,5°C (, уксусная ки лота), ,05y Вещество Rf 0,35: Вещество Т 0 1:1-1:2 (хроматография в тонком сл хлороформ:метанол:уксусная кислота 94:4:1). Кристаллы после второй кристаллизации:т.пл. 253-254°С (разложение. ), сх -91, 5Ъ (С 0,5, уксусная кисло та),- LDj 0,05. Эти кристаллы главным образом содержат вещество с RJ 0,35 и следы вещества с Rj 0,42 (хроматография в тонком слое, хлороформ:метанол:уксус ная кислота - 95:4:1) . Кристаллы после третьей кристалли зации: т.пл, 254-255°С (разложение) oL -95, (С 0,5 уксусная кисло та) ,05T. 5 Эти кристаллы содержат главным о разом вещество R, 0,39 (пепстатин В) и следы вещества, имеющего Rj 0 (хроматография в тонком слое, хлороформ: метанол: уксусная кислота -95:4 Найдено, %: С 60,14; Н 9,38; 9, Полученные вещества .умеренно раст воримы в диметилсульфоксиде, диметилформамиде и уксусной кислоте, трудно растворимы в метаноле (5-10 мг/мл), но более растворимы, чем метиловый эфир пепстатина. Пример. 4. Штаммом, образую щим пепстатин,. заражают 130 л стерил ной среды состава, вес.%: Глюкоза6,0 Глицерин 2,0 Снятое молоко 4 Молочный каз еин 4,5 0,1 0,3 Mg-SO -TH O 0,1 (рН 6,8) и инкубируют как в примере 1. К 125 л культуральной жидкости, оодержащей антипепсннное вещество в количестве, эквивалентном 170 г пепстатид добавляют 60 л и -бутанола и пере- . мешивают 40 мин при колтатной текшературе. После этого бутанольный вод ный и твердый слои (мицеляльная масса) разделяют центрифуг-ированием. ВутанольИый слой прО1«лвают водой и концентрируют в вакууме до.1,5 л сиропа. рН сиропа доводят до 3,0, добавляют 7,5 л И -гексаиа и при перемешивании получают желтовато-корич невый осадок. После 60-минутного перемешивания осадок;Отфильтровывают, npoiuf:JBaKT и васуишзсоо-г в вакууме и получают 164 г нового неочищенного пепстатина, имйощего антипепсинную активность LDj 0,0757 . 150 г нового пепстагина растворяют в 1,5 л 90%-ногЬ метанола при и обесцвечивают 150 г активирован.ного угля.К 1,6 г обесцвеченного метанрльного раствора добавляют 1,0 л воды при комнатной температуре и получают студенистый осадок. Осадок отфильтровывают, промывают метанолом, лиофилизируют и получают 94 г слегка желтоватого порошка. Его 1.0 по отношению к пепсину 0,062 J. Этот порошок растворяют в 90%-ном метаноле, дважды обрабатывают активированным углем и получают 15 г порсяика нового пепстатина. Его LDjo 0,05520, точка разложения 198-205°С и -79С (,0 метанол). При хроматографии в тонком .слое он имеет Rj 0,35 (пепстатин) г 0,39 (пепстатин В и пепстатин С) и RJ 0,42. Пример 5. Штаммом, образующим пепстатин, заражают 130 л стерильной среды состава, вес.%: Глюкоза6,0 Глицерин 2,0 Снятое-молоко 1,5 Казеин1,5 Соевая мука 5,7 -0,1 NSce0,3 HMg-Sp -THjO 0,1 (рН 5,5) и инкубируют,, как в примере 1. 110 л культуральной жидкости, содержащей антипепсинное вещество в количестве, эквивалентном 132 г пепстатина, отфильтровывают с добавлением 7 кг вспомогательного средства для фильтрования; с помощью разбавленной серной кислоты рН доводят до 2,0 и отделяют 33 кг мицеляльного остатка и 75 л фильтрата. К шцеляльному остатку добавляют 82 л абсо.пютного метанола и получают взвесь, которую перемешивают 40 мин. .-После этого взвесь отфильтровывают и остаток дважды пробивают 40 л 70%ного метанола и получают 140 л водного метаиольного элюата. К этому фильтрату добавляют 35 л Л -бутанола и после 15-минутного перемешивания отделяют 37 л бутанольного слоя от 73 л водного слоя. 140 л вышеуказанного водного метанЬльного эхпоата, полученного .из мицеляльного концентрируют в вакууме до 37 л водного раствора и смешивают с 37 л бутанольного экстракта, полученного из фильтрата культуральной жидкости. Эту смесь центрифугируют для удаления водного слоя и получают 35 л бутанольного экстракта. После доведения рН бутанольного экстракта до 3,0 его концентрируют в вакууме до 1 л сиропа. Этот сироп по каплям добавляют в 15 л , перемешивают и получают осадок. Осадок отфильтровывают, ..про швают водой. высушивают при бО-ТО С н получают 153 желтоватого порошка нового пепстатина имеющего антипвпсинную активность LD. О,О72 jr. Полученный порошок этерифицируют метанолом, как описано в примере 1/ и получают 62 г белого кристаллического порошка метилового эфира нового пепстатина. Его ,05 Т точка разложения 250-352С и , (С «0,5, уксусная кислота). С помощью хроматографии в тонком слое устанавливают, что он содержит главным образом метиловый эфир нового пепстатада ( R, 0,39) и следы метилового эфира пепстатина. 30 г полученного метилового эфира нового пепстатина оь иляют в 450 мл раствора 0,2 н. На ОН в 90%-ном метаноле в течение 2 ч при 60°С. С помощью разбавленной НСЕ рн реакционной смеси доводят до 3,5 и смесь концентрируют до 150 г.Л с образованием осад ка. Осадок отфильтровывают,промывают метанолом, высушивают в вакууме и получают белый порошок (17,9 г) натрие.вой соли нового пепстатина, .имеющий 0,05 Т , т.пл. 245-249 с (раэложение) и СсА.--34 (С 1,0 метанол При его титровании на 700 мг расходуется 10, 1 t-m 0,1 н JiCe.П р и м а р 6. Штаьмом, образующим пепстатин,заражают 130 л стерильной среды состава, весЛ: Глюкоза6,0 Глицерин2,О Молочный казеин 4,2 Пептон1,0 KjHPO - , 0,1 Notce0,30 Mg-SO TH O(рН 7,0) 1 и инкубирование проводят 132, 5ч в условиях, указанных в примере 1,130 культуральной жидкости, содержащей ан типепсинное вещество в количестве, э вивалентном 111 г пепстат1-на, обрабатывают так же, как в примере 1, и пол чают 132 г неочищенного нового пепста тина, имеющего i-D- по отношению к пепсину « О, 076 ТПолученный таким образом желтый порошок обрабатывают, как бписано в примере 1, и получают 53,5 г метилового эфира нового nertcTaTHHa, имеющего LD 0,051 у, разложения 255-25б С iild- ° -95,5 (С 0,5, ук сусная кислота). С помощью хроматографин в тонком слое опре,целйют . J г 0,35 и Я 0,39 (1:1), но Т. 0,42 отсутствует. Полученный такимобразом пепстатиновый препарат содержит равное количество нового пепстатина (Isl) , Пример 7, Новый пепстатин в свободной кислотной форме (4 г) р получонный в примере 2, растворяют в 100 мл абсолютного этанола при нагре вании и добавляют 2 мл концентрированной . Эту смесь нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане 6 ч и концентрируют в вакууме до 50 мл. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают этанолом, высушивают и получают 16 г порошка. Порошок перекристаллизовывают из абсолютного этанола (100 мл) и получают 1,15 г белого кристаллического порошка этилового эфира нового пепстатина (этиловый эфир пепстатина В) имеющего 0,052 т, точку разложения 250251° С и al -90°(С 0,5, уксусная кислота). При мер 8. 3,0 г нового пепстатина, полученного в примере 2, растворяют в 100 МП абсолютного и -пропилового спирта при нагревании, добавляют 0,2 мл концентрированной серной кислоты и этерифицируют 6. ч при . Реакционную смесь концентрируют в вакууме до 20 мл с образование осадка. Осадок отфильтровывают, промывают Н -пропиловым спиртом, высушива.ют и получают 900 мг белого порошка. Этот порошок перекристаллизовывают из 40мл абсолютного пропилового спирта и получают 480 мг белого порошка ( -пропиловый эфир пепстатина В), Он имеет 0,073, т.пл. 218-220 С (разложение) и сА.° -89, 5° (С 0,5, уксусн ая кислота) . При мер 9.3,0 г пепстатина, полученного в примере 1, растворяют в 100 мл теплого абсолютного н -бутанола и добавляют 0,2 мл концентриро.ванной серной кислоты. Этерификация продолжается 6 ч при 80°С, раствор концентрируют в вакууме до 2 мл с образованием осадка. Осадок отфильтро-. Бывают, пробивают ,И -бутанолом, высушивают и получают 800 мг белого по- рошка. Порошок перекристаллизовывают из н -бутанола и получают 340 мг белого порошка ( Ai -бутиловый эфир нового пепстатина В) , имеющего LB 0,084.Т, т.пл. 205-207°С (разложение) и , -88 (С 0,5, уксусная кислота). Формула изобретения Способ получения пепстатинов путем, выращивания штамма -Stpepto m ч ces testa cen s. АТСС №21469 или otreptom-ates otgrentudEuS var-tovonocensis ATCC 1 21468 на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли с последующи. выделением целевого продукта,о т ji и ч а ющ и и с я тем, чуо, с целью получе ния пепстатинов В и С, в качестве ис.точников азота используют казеин, сня9588927 0

тое молоко и/или соевую муку, целевой Источники информации, принятые во

продукт экстрагируют и этерифидируютвнимание при экспертизе: низшим спиртом и отделяют в виде низ- 1. Journat Ahtitoiotics W23, 5,

шего алкилового эфира.Р.259, 263.