Реактив для определения холестерина Советский патент 1979 года по МПК A61B10/00 G01N33/16 

торы и поверхностно-активные вещества. Все эти добавки обычно применяются в системах для обнаружения нерекнси водорода соответственно холестерина. Преимущественно в упомянутых выше комбинапиях реагентов отдельные составные части содержатся в следующих соот ношениях: 1.От 13 до 150 об. холестеран-окси дазы, а также от 2 «10 до 5- мерческой каталазы, от 0,О5 до 6,2 мл| ацетилацетрна и от 2 до 10 мл метилового спирта добавляют в 100 мл буфера, содержащего ионы аммония (рН 5-7). За тем добавляют 0,02-О,3 мл поверхностно-активного вещества (предпочтительно гидроксиполвэтоксидодекана}. 2,От 3 до 40 об. холестегрин-оксидазы, а также от 2 10 до 1 «10 коммерческой пероксидазы, от 5О до 200 мг 2,2 .«манобенэтиааолннсул1 фокислоты, а также от 0,05 до 0,5 мл повер сностноактивного вещества (предпочтительно гидри оксиполиэтоксндекана) добавляют в 100мл ;буфера (рН 6-8, 3,От 0,1 до 1 об, холестерин-оксидааы, от 1 до 5 мл 1 М раствора 2,4-ди- Нйтрофенилгидразина и, в некоторых случа Ях, от 0,005 до 0,1 мл поверхностно-ак- тивного вещества, 4.От 2 до 100 od холестерин-оксида- эы, а также от 0,1 до 2,0 мл поверхност но-активного вещества (преимущественно гйдроксипблиэтоксидодшсана) добавляют в 50 мл буфера (рН 5-9) преимущественным образом 0,5 М натрийфосфатного бу|фера (рН 7,5), Холестерин-оксйдаэа npefjf ставляет собой фермент, который катализирует реакцию: О хопестерин-оксидаза Холестерин + холестенон + Реакция протекает количественно, благодаря чему возможно абсолютно специфи- Ч1вское н точное количественное определение холестерина. Реактив пригоден для определения холестерина в таких водных средах, тракты продуктов питания жидкости, содер жащиеся в теле, в особенности сыворотки, Благодаря большой специфичности реактива может быть произведено определение только свободного холестерина. Однако связанный холестерин, который как извест но находится в этерифицированной форме, равным образом может быть определен после предварительного химического или ферментативного омыленая. Химическое 3в .4 омыление проводит, например, под деист- Ёйем спиртового раствора гидроокиси калия, а ферментативное омыление - эстера- ЗОЙ, преимущественно холестерин-остеразой, полученной из печени или поджелудочной железы. Пример 1, Определение по перекиси водорода. Гидрофосфат аммония (10 г) pacTBOpHiют в 100 мл воды и посредством прибавпения 85%-«ой фосфорной кислоты устанавливают значение рН 7,0, Затем прибавляют 10 ор, каталазы. Приготовленным раствором доводят смесь, содержащую 0,2 мл адетилацетона и 10 мл метиловото спирта, до 1ОО мл, .Затем 7,5 мл полученного раствора смешивают с 0,5 мл Сыворотки, соответствеЕио с 0,5 мл стандартного раствора холестершш, содержащего 200 мл % холестерина, Аликвотные с)личества растворов, содержащих сыворотку, а также стандаргн6г раство ра Хйпестерина смещивают в каждом случае с 5 об, холестерин-оксидазы и 0,02 мл 10%-ного раствора гидроксйполиэтоксидодекана в выдерживают смеси в течение 70 мин при , Затем фотометрически определяют коли- «jecTBO образовавшегося красителя при 405 нм. Со стандартным раствором .холестерина строят калибровочную кривую. Содержание холестерина в пробе, содержащей сыЁоротку, определяют при использований стандарта в качестве величиныдля сравнения. Контрольное определение, проведенное по Лиеберману и Бурхарду, дает Ътклонение примерно 5%, Пример 2, Определение перек.иси водорода, К 3 мл калийфосфатного буфера с рН 7 (насыщен кислородом/, вГкотОром содержится 100 мг % 2,21 минобензтиазолинсульфоксилоты, прибавляют 0,05 мл 20%-ного раствора гидроксиполиэтоксидодекана и 0,02 мл коммерческого раствора пероксидазы, а также 0,02 мл перекиси водорода для удаления. Восстанавливающихся веществ. За смесью наблюдают с помощью фотометра в области 405 нм или 436 нм. Как только реакция подходит к завершению, прибавляют 0,01 мл сыворотки (разбавленной водой в соотношении 1:15), Спустя 10 мин прибавляют 0,15 об, холестерин-оксидазы и спустя еще 10 мин определяют разность экстинкций. Точно таким же способом, но при использовании стандартного раствора холестерина с содержанием 200 мг % строят