Способ получения -лизина Советский патент 1979 года по МПК C12D13/06 

1

Изобретение относится к технике получения U -лизина путем культивирования бактерий вида NocaP ia на питательной среде.

Известен способ получения L -лизина культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода в условиях аэрации на питательной среде содержащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли с поспёдующим выделением Ь -лизина ij.

Недостатком известного способа является то, что он не обеспечивает достаточно высокого выхода L-лизина.

Целью изобретения является повышени выхода L -лизина.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения L,- лизина из рода Nocardia используют штаммы

Mocardia a 1 anoQfeutinousa №22359 (АТСС 31220) и (АТСС 31221), устойчивые к S -(2-аминоэтил) L - иле тин у.

При этом в качестве источника угле-рода используют животное масло или жир или растительное масло.

Кроме того, в качестве источника углерода используют жирную кислоту.

Кроме того, в качестве источника yi лерода используют этиловый спирт.

Кроме того, в качес-те источника углерода используют глюкозу или фруктозу, или крахмал, или продукт гидролиза мелассы или крахмала.

Кроме того, в качестве источника углерода используют уксусную кислоту или лимонную кислоту.

А также, кроме того, в качестве источника углерода используют П -алкан,. содержащий от 14 до 19 атомов углерода или керосин, или сырую нефть, содержащую П -алкан.

При этом рН питательной среды после культивирования микроорганизмов доводят до 1-3 и выдержаивают в течение 5-12О мин при 8О-1ОО°С. Кроме того, рН питательной среды после процесса культивирования микроор. г-анизмов доводят до 7-9 и выдерживают от 5 минут до 5 суток при 8О- 100°С. Способ осуществляют следующим образом. Продуцирующие L -лизин микроорганизмы из рода iocoiгdidкyльтивиpyют в условиях аэрации на питательной ереде, содержащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли. Из рода Nocardio используют щтаммы Nocardios a 1 anog&utihousa № 223-59 (АТСС 31220) и № 22315 (АТСС 31221), устойчивые к S- 2-аминоэтил) Ь-цистину (ЛЕС). Микробиологические свойства указанных штаммов аналогичны микробиологическим свойствам исходного штамма № 223, за исключением того, что первые два штамма обладшот стойкостью к ЛЕС, а последний нуждается в помосе рине. Морфология, Форма, Ранняя стадия выращивания: 0,8-1,0x4-15, прямые или изогнутые палочки, о№1ечается наличие ответвлений; стабильная стадия; сферическая или короачсая палочкообраз ная, близкая к форме сферы, Грам-травление положительное, быстрое кислотное травление отрицательное, подвижность отсутствует. Эндогенные споры отсутствуют; клетки на стойкой стадии выращивания выде живают при 80 С одночасового нагрева в физиологическом растворе. Условия выращивания-. Колония выращена на агаровой пластинке в течение 3 суток при 33 С, фор ма округлая, рост хороший, окраска бледно-ро.зовак, колония непрозрачная, влажная, гладкая. Культивирование на скошенном агаре в течение 3 суток при 33 С, колония нитевид1-1ая, рост хороший, окраска бледно-розовая, колония влажная, гладкая, наличия воздушного мицелия не отмечае ся. Культивирование на питательном буль не.при 33 С. На поверхности образуеахз тонкая пленка, отмечаются осадки. Питательная желатина не ожидается, выращивание на поверхности и в верхней части, Локмусовое молоко: щелочная реакция без коагуляции или пептазашп. Филиологические свойства. Крахмал не гидрализует, восстанавливает нитраты, индол образует, сероводород образует, уреазу не образует, проба V-P-отрицательна, испытание метилкрасным отрицательно, реакция на каталазу положительная, целлюлозу не разлагает, потребность в питательной среде отсутствует, разложение дезоксирибонуклеиновой,кислоты (ДА) отсутствует, чувствительность к лизошшу имеется, эскулин разлагает, к пенициллину (5 единиц/мл. метод диска) не чувствителен. Ассимилирует в качестве источника углерода фруктозу, глюкозу, маннитол, сорбитол, фенол, молочную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, ацетамид, тирозин, этанол, маннозу, fi-алканы,: текстрин, масла и жиры, жирные кислоты. Образование кислот из Сахаров: кислоты образуют из глюкозы, фруктозы, сорбитола маннитола, глицерина и трехалозы, отсутствует образование кислот из ксилозы, галактозы, сахарозы, лактозы, мальтозы, инозитода, декстрина и крахмала. Оттимальная температура выращивания от ЗО до 37 С, рост наблюдается в диапазоне 10-4О С, рН роста 8-9, аэробен относительно кислОрода. Состав клеток. Содеряшт 1 11-диаменопималовую кислоту, галактозу, и арабинозу. В питательной среде в качестве источника углерода при выращивании- используют животное масло или жир, растительное масло, жирные кислоты, этиловый спирт, глюкозу,фруктозу или крахмал, или продукт гидролиза мелассы-или крахмала, уксусную или лимонную кислоту, Vi-алканы, содержащие 10-30 атомов углерода, а также углеводороды, такие как керосин -и неочищенная нефть, В качестве источников азота используют . ацетат аммония, сульфат аммония, х/1бристый аммоний, нитрат аммония, водный раствор аммиака, аминокислоты, смесь аминокислот, экстракт дроио сей, пептон иэкстракт мяса. При нeoбxoдимov сти вводят также соли неорганических кислот, такие как фосфаты, соли кальция, магния, калия, натрия, железа, маргаяиа, цинка и следы металлов. Эти компоненты питательной среды вводят до стерилизации или отдельными порШ5ЯМ11 в :процессе ферментации. Выращивание осуществляют со встряхиванием или при аэрации и перемещива-НИИ при рН 6-9, предпочтительно 6-8, температуре от 20 до 4О , предпочтительно от 27 до З7с, Питательный бульон после окончания процесса культивирования приобретает значительную вязкость, что препятствует его фильтрации, вследствие чего в него добавляют неорганическую кислоту с доведением рН до 1-3 или щелочь с доведением рН до 9 и более, после чего бульон подвергают нагреву при 80 С и выше в течение 5 мин. L,-лизин вьщелшот из фильтрата, например путем адсорбции ионообменной смолой IR -120 или IR-84, промывают водой и элюируют аммиачным раст вором. Эпюат сгущают, нейтрализуют концентрированной соляной кислотой и высушивают, получая высокочистый гидрохлорид L-лизина. Количество полученного L-линиза оценивают биопробой с использованием мутантного штамма EsctiericllJCfCOti и с помощью аминокислотного анализато П р и м е р 1 о Выращенные по полной петле в бульоне на скошенном агаре клетки бактерий NocotrdlO aetono eut nousa № 223-59 (АТСС 3122О),. а также № 223-15 (АТСС 31221) выдерживают в чв.чение суток при 33 С в пробирке, содержащей 10 мл питательной среды следующего , г: П-алканы ( )- 50,0; сульфат аммония - 4О,О; Са СО - ЗО,0; KgHPO 0,5; КН PC -0,5; .: NaC -1,О; Fe504-7H2«- -Ю мг; ЛЛп5Од4Н2О - 10 мг; вода водопроводная - 940 мл, рН - 7,0, температура 120 С (парообразование в течение 15 мин). Культивирование проводят в течение одних суток при 33 С со встряхиванием 1 мл полученного бульона высевают в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую ЗО мл той же питательной среды, и выдерживают 5 суток при 33 С со встряхиванием. При этом получают L-лизин (гидрохлорид), г/л: Nocardia aC-kano Eutinousa № 223-59 (АТСС 31220)-19,5; Nocundia atkanoge.utinousa № 223-15. (АТСС- 31221)-2б,7П р и м е р2. Выращенные в бульоне на скошенном а га ре бактерии Nocar3ia а 1 аWg-euUnosa №223-59 (ЛТСС 3122О) и выдержанные b течение одних суток при 33 С петлей вводят в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 50 мл питательной среды такого же состава, как описано в примере 1, за тем исключением, что вместо Ц-алкана используют кукурузное масло или рыбий жир. Культивирование проводят со встряхиванием. В результате пятисуточного выращивания получают 5,8 г/л L-лизина (в виде гидрохлорида) в случае введения в питательную среду кукурузного масла или 6,3 г/л в случае введения в нее рыбьего жира. П р и м е р 3. Выращенные в бульоне на скошенном агаре в течение одних суток при 33 С бактерии NocotPdia oCtonogCuiinousa № 223-15( АТСС 31221) вносят петлей в 5ООмииллиметровую колбу Сакагучи, содержащую ЗО мл питательной среды такого же состава, как описано в примере 1, за тем исключением, что вместо П-алканов используют стеариновую или маргариновую кислоту. Выращивание проводят в течение 5 суток при 33 С со встряхиванием. Количество накопленного в виде гидрохлоридов Ь-лизина составляет 15,3 г/л при введении в питательную среду стеариновой кислоты и 14,4 г/л - при введении в питательную среду маргариновой кислоты, П р и м е р 4. Выращенные на скощенном агаре бактерии Nocothclja aClcanogreutinou&a .. № 223-59 (АТСС 3122О) вносятпетпейв 5ОО-МИЛпиметровуюкопбуСакагучи, содержащую ЗО мл питательной среды, имеющей такой же состав, как в примере 1, за тем исключением, что вместо -И-алканов используют этиловый спирт, вводимый порциями, не превышающими 1%. Выращивание осуществляют со встряхиванием. В результате пятисуточного выращивания получают 13 г/л t-лизина (в виде гидрохлоридов). П р и м е р 5. Выращенные в бульоне на скошенном агаре в течение одних суток при 33°С бактерии NOCOrdia CiClcanogeutinousaX)223-15 (АТСС 31221) петлей вносят в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую ЗО мл питательной среды, как в примере 1, где выращивают при 33 С в теченйе;0яних суток со встр5гхиванием.

5 мл полученного бульона вводят в 2- питровую колбу Сакагучи, содержацую 2ОО МП такой же питательной среоы, как в примере 1. Выращивание осуиествлают Д в течение одних суток при 33 С со встряхиванием. 600 мл полученного бульона переносят в-30 - питро рый сосуд, содержащий 10 мл производящей L-лизин среды указанного ниже состава. Культивирование проводят при 33 С с перемешиванием при 400 об/мин и с пропуском 9 л воэдуха в минуту, В процессе культивирования среду нейт рализ5 ют водным раствором аммиака до рН 7,0. Спустя 96 часов культивирования получаю 52,5 г/л L-лизина ( в виде гидрохлоридов). К 1 п полученного бульона добавляют концентрированную серную кислоту, до достижения рН 1.5. Затем осуществляют нагрев при 100 С в течение 20 мин и фильтрацию. Фильтрат пропускают через 1шнообменн5Г о смолу типа . IR-120, NH , адсорбирующую Ij-лизин. Затем промывают водой и эшоируют аммиаком, Элюирован. ные фракции подвергают сгущению, иейт рализации ,концентрированной соляной кис лотой и сушке. Получают 45 г гидррхлорида L-лизина со степенью чистоты выше 98%.

L ЛИЗИН среды

Состав производящий

)

И алкан (С - С

100 г„

19

Сульфат аммония

35,0 г 1,0 г

СаСе,

Масе 1,0 г 1,0 г к 2 HP о. 1,0 г

KHg Р04 0,5 г Mg ЗОд

71-1 О

1ОО мг 711 2 О ре 50

Ми SO,. 20 мг ZnSO.-ТНоО 20 мг

870 мл

Вода из водопровода 7,0

Р

Температура 120 С (парообразование в течение 15 мин)

Примере. К 1 л пол.3ч:еиного в примере 5 питательного раствора добавляют необходимое для доведения рН до 11 количество гидроокиси калышя. Раствор нагревают 30 мин при 100 С, а затем в течение двух часов через него пропускают воздух. рН раствора доводят добавкой концентрированной серной кислоты до 5,0. Затем раствор фильтруют. Фильтрат пропускают чере. ионообменнук смолу типа 1R 120, NH, которая адсорбирует «чпизин. Далее промьтают водой и элюируют аммиаком.

Элюированные фракции подвергают сгущению, нейтрализуют концентрированной соляной кислотой и сушат. Получают46г

L-лизина (в виде гидрохлррида) с чистотой, превыщающей 98%.

Пример7, Выращенные в течение одних суток при 33 С в бульоне на скошенном агаре бактерии atkano Eutinouscs N9 223.15 (АТСС 31221) петлей высевают в 500--миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 30 мл питательной среды, аналогичной по составу среде, упомян, той в примере 1, за тем исключением, что вместо п-алкана используют глюкозу. Культивирование ведут в течение четырех суток при 33 С.,

Количество накопленного в среде U -лизина составляет 0,5 г/л ( в виде гидрохлорида).

П р и м е р 8. Выращенные па скошенном агаре бактерии NoccStUics qe,1ca (logtut-inoubo , .№223-15 (АТСС 31221), культивирование велось в течение 1 суток при температуре 33 С петлей вводят в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 30 мл среды, аналогичной по составу среде, использованной в примере 1, за-тем исключением что вместо И-алкана вводят уксусную кислоту порциями, не превышающими О, §% Далее выращивают в течение четыреху, и уток при 33 С, со встряхиванием. Количество полученного в виде гидрохлоида

L -лизина составляет 22 г/л,

П р и м е р 9. Штамм. Nocardia с kanog-eutinousa № 223-59 (АТСС 31270), продуцирующий Ц-лизшг выращивают в питательной среде, содержащей Н-парафин, включающий 14-19 атомов углерода, в качестве основного источника углерода. Питательный жидкий бульон разделяют на порции по 20 мл каждая. Величину рН разделенного питательного бульона регулируют, доводя до 1,5; 2,0; и 3,0, и

осуществляют на80°Сгрев при 8О С 5 мин, при 10 мин, при 10О С - 2 часа. Фильтрацию осуществляют с использованием стеклянного фильтра ЗО-2 испи.ратора, результаты представлены в таблице. 9 Продолжение табли Формула изобретен и 1.Способ получения L-лиаина путем культивирования продуцирующих его мик роорганизмов рода Nocardia в условиях аэрации на питательной среде, с держащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли с последующим выделением L-лизина, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода, из рода NO используют штаммы Nocardia abkano e.uti поиьа № 223-59 (АТСС 31220) и №223-15 (АТСС 31221), устойчивые к S -(2-аминоэтил) U -цистину., . 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве источни углерода используют животное масло ил жир, или рж;тительное масло. 4 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют жирную кислоту. 4.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что в качестве источника углерода используют этиловый спирт. 5.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что в качестве источника углерода используют глюкозу или фруктозу, или крахмал, или продукт гидролиза мелассы или крахмала. 6.Способ по п. 1, отлича ю- щ и и с я тем, что в качестве источника углерода используют уксусную кислоту или лимонную кислоту. 7.Способ йо п. 1, отличающий с я тем, что в качестве источника углерода используют Ц-алкан, содержащий от 14 до 19 атомов углерода или керосин, или сырую нефть, содержащую п -алкай. 8.Способ поп. 1,отличающ и и с я тем, что рН питательной среды после культивирования микроорга-i низмов доводят до 1-3 и выдерживают в течение 5-120 мин при 80-1ОО С. 9.Способ по п. 1, отличающ и и с я тем, что рН питательной среды после процесса культивирования микроорганизмов доводят до 7-9 и выдерживают от 5 минут до 5 суток при 80-120 С. Приоритет по пунктам 17а0.75 по п. 1; 22.10.75 по пп.2-9. Источники информации, приня1ые во внимание при экспертизе: 1. Акц. заявка Японии № 47-43О73, кл. С 12 Б 13/О6, 1972.