Способ получения монокариотического мицелия гриба coRIoLUS VeRSIcoLoR (FR) QUeL Советский патент 1983 года по МПК C12N1/00 

не определялось наличие мицелия в виде пластинок.

Создают обогащенные питательные условия применением среды с 1,5-3 раза более высокой концентрацией ,чем в обычной среде, например глюкозо-дрожжевым экстрактом,содержащим О, 75% дрожжевого экстракта и 5% глюкозы.

Атмосферу погруженной культуры поддерживают при сниженном парциальном давлении кислорода. Такое сниженное давление кислорода создают -при воздушной герметизации ферментора нли подачей в ферментатор инертного газа, например газообразного азота или двуокиси углерода. Выраццивание ведут непрерывно при дополнительной подаче культуральной среды.

Свойства

Внешний вид;

погружная культура

плоская культура

Микроскопические наблюдения:

образование сцепляющих соединений

форма мицелия

Физиологический и биохимические свойства:

скорость размножения

ассимиляция целлншозы

единственный источник азота-нитрат калия

тиамин

среда лакмусового молока

Скорость размножения монокариотического мицелия в 1,5-10 раз больше скорости размножения исходного дикариотнчвского мицелия, высокая скорость размножения имеет важное значение для промышленного производства.

Этот Монокариотический мицелий можно применить для тех же цеЛей,

ЕСУ1И нельзя получить достаточного количест&а монокариотического мицелия за один опыт выращивания,то обработку ведут после гомогенизации культуры до получения нужного количества монокариотического мицелия. Выращивание ведут при температуре 25± 5®С в течение от 3 до 15 дней.

Монокариотический мицелий гриба Corlofus versl-color (Fr) Quef хранихСя в Исследовательском институте ферментации, Агенства промышленной науки и техники (Циба-ШИу Япония) под номером FERM-P 3686,

СвЬйства мойокариотического мицелия гриба Сог1 о (us versicoPor (Fr) Uuet представлены в табл, 1.

Таблица 1

Ионокариотический мицелий

Суспендированное состояние Не образуется

Не наблюдаются

Более короткий и толще, чем дикариотический мицелий

Высокая

Слегка положительная

Есть рост Не требуется

Не кислая

что и дикариотический мицелий Corlofus versIcoPq/ (Fr) QueP. Например, можно получать азотсодержащие полисахариды путем его экстракции водной средой, например водой, разбавленным щелочным раствором или разбавленным кислотным раствором, такое азотсодержащее полисахаридное вещество можно применять для получения

лекарств, например( противоопухолевых препаратов, активирующих иммунитет препаратов, противовирусных лекарств, противогрибковых препаратов, противопрокаэных лекарств, усиливакхцих аппетит препаратов.

Можио также получить различные виды энзимов, напрИАюр протеазу, амилазу путем низкотемпературной экстракции. Кроме тога, сам мицелий или его. Экстракты 11пи остатки можно применять в пи1це и напитках на корм скоту и удобрениях для растений.

П р и мер 1. Получение моно кариотического мицелия.

100 МП жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта пипеткой загружают в коническую колбу на 500 МП и после паровой сте1рш1изации в течение 20 Мин при 120 С в авто1славе, среду инокулируют 1 МП суспензии мицелия, полученного диспергированием мицелия CorfoBus verslcotor IFr) Quef, полученного из 20-дневной стационарной культу :, вкгращенной при 25с с ис-. псхльзованием жидкой среды, содержащей. 3% глюкозы и 0,5% дрожжевого экстракта в 60 мл физиологического солевого раствора путем дробления мицелиального мешалкой при скорост и ее 6000 об/NOiH в течение 3 мин, затем начинают вырахцивание при встряхивании при скорости мешалки 200 об/мин при . Череа 3 дня после начала культивгщии кфащешшй материап переносят в асептических условиях в смеситель на 200 мл и после измельчения вещества гомсмиксером пр скорости 10.000 об/мин в течение 10 мин возобновляют сразу выращивание при встряхивании и продолжают в течение 7 дней. Полученный таким способом мицелий не имеет сцепляющихся соединений и плохо дает воздушный мицелий в стандартной среде из агара Результаты микроскопического исследо вания после окраски, приведенные ниже, показали, что весь полученный мя целий является кюнокариотическим.

1 мл бульона,содержащего мицелий попученный как указано выше, добавля ют к 10 МП воды, затем ведут центрифугирование при 2000-5000°С в течение 5 мин. Верхний слой жидкости удаляют и мицелий переносят в пробирку, в которую добавляют-фиксирующую жидкость Хелли. После выдержки в течени 24 ч отделенные клетки промывают 10 мл воды до их обесцвечивания. Затем клетки помещают в 10 мл 3 Н соляной кислоты и нагревают при в течение 15 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, промывают 10 МП воды, затем на 2 мин погружают в 10 ivin разбавленной в 20-50 раз азотной кислоты и 2-3 раза промывают по 10 мл воды.

Полученные волокнистые клетки раскладывают на стеклянной пластине для испарения влаги, затем на. волокна наносят несколько капель раствора Гимса и после 15-минутного выстаивания, их. npoMJB ajoT слегка водой, затем сушат .

При изучении окрашенных таким образом ядер клетки под хшкроскопом с увеличением 1000,раз, каждое ядро видно в виде красной круглой точки. Поэтому можИо легко определить .число ядер подсчетом круглых окрашенных в красный цвет точек в одной клетке aIцeлия. Полученный мицелий не подкисляет лакмусовое молоко и не разжижает желатин.

Размножение монокариртического мицелия.

МонркаЕяютический мицелий, полученный описанным вьвае способом, добавляют в 12 л жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экртракта, и загружают в чашечный ф ментатор на 20 л, затем прямо в ферментатор подают водяной пар под давлением 2 кг/см. После паровой стерилизации при в течение 20 мин и охлаждения, 1 л суспензии, содержащей монокариотически мицелий инокулируют (со скоростью 0,5 г/л) сразу вслед за этим ведут культивирование при скорости аэрирования 0,5. объем.объем/мин и скорости перемешивания 550 об/мин. Для сравнения ведут культивирование дикариотического мицелия полностью при таких же условиях как и для МО нокариотического мицелия. При сравнении скорости размножения этих моно- и дикариотического мицелия, по времени, требующемся для достижения концентраций мицелия 8 г/л бьшо установлено, что монокариотический мицелий требует aqero 1/4 част времени культивирования по сравненики со временем для культивирования дикариотического мицелия. Выло также подтверждено, что выход монокариотического мицелия выше на 20% по сравнению с дикариотическим мицелием.

Пример 2. Производят подсчет числа ядер по методике из примера. 1 в мицелии, полученном из культуры скошенного агара Coriofus verslcofor (Fr) QueP. В результате было установлено, что все эти клетки были дикариотические, моыокариотические не были обнаружены.

100 мл жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, помещают в коническую колбу на 500 мл.и стерилизуют ее там при нагреваний. Затем эту среду инокулируют дикариотическим мицелием с помощью платиновой петли, затем ведут выращивацие при встряхивании в течение 3 дней (предварительное выращивание) при температуре 25 ± . Таким образом, получают мицелий в форме

пластинок. Бульон, содержащий этот пластинчатый мицелий, .гомогенизируют гомосмесителем в течение 5 мин, затем обрабатывают на срезывание,при этом пластинчатая форма почти исчезла. Культивирование ведут при вышеуказанных условиях и через 4 дня (основное культивирование полученный пластинчатый мицелий снова гомогенизируют в течение 5 мин и снова обрабатывают срезом. Концентрация клеток грибка на этой стадии составляет 11 г/л.

1 мл бульона, содержащего гомогенизированный мицелий, добавляют в ту же жидкую среду, которую применяют в первом опыте культивирования, затем ведут второй опыт культивирования при таких же условиях как и в первом опыте. Период культивирования несколько изменяют, предварительное культивирование ведут в течение 3 дней, а время основного сокращает до 3 дней. Концентрация грибковых клеток почти такая же, как и в первом опытейыращивания при встряхивании.

Третий опыт выращивания продолжают таким же образом, причем концентрация грибковых клеток достигает почти такого же уровня, как в первом опыте выращивания при встряхивании в течение 2 дней предварительного культивирования и 3 дней основного культивирования.

Аналогично ведут четвертый опыт культивирования и получгиот бульон с концентрацией грибковых клеток 12 г/л, выше чем в первом опыте,но при двухдневном предварительном культивировании и при двухдневном основном культивировании. Полученный мицелий не имеет формы пластинок и находится диспергированным в виде пульпы и не требует гомогенизационной обработки.

Как установлено микроскопом грибковая клетка не имеет сдепляняцих соединений, которые имеются в обычном дикариотическом мицелии, она почти вдвое шире по сравнению с дикариотическим мицелием.

При определении числа ядер по описанному в примере 1 способу, было подтверждено, что эти клетки полностью представляют собой монокариотический мицелий,

При дальнейшем размножении мицелия при таких же условиях, как в предьадущем опыте, размноженный мицелий состоит из монокариотического мицелия и обладает всеми свойствами монокариотикеского мицелия, показанным в табл. 1.

Также установлено, что скорость размножения монокариотического мицелия более чем в два раза превосходит

скорость размножения дикариотического мицелия..

10 г высушенного продукта монокариотического мицелия, полученного /по примеру 1, экстрагируют 300 мл 5 горячей врды при 95-100 С в течение 3 ч. Экстрактный раствор концентрируют при пониженном давлении при 30, затем к нему добавляют чистый зтанол с концентрацией 90% образовав0 шийся осадок оушат и получают 0,2 г Серого порошка.

Химический анализ этого серого порошка подтверждает, что это вещество представляет собой азотсодержащий

5 высокомолекулярный полисахарид. При введении этого вещества мышам с трансплантированной опухолью саркомы -189 твердого типа, оно показывает высокую противоопухолевую актив0 ность.

Пример 3. 100 мл жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, помещают в кое ническую колбу на 500 мл, в которой .уже находилось 8 г стеклянных шариков диаметром 2-5 мм, эту смешанную среду после тепловой стерилизации заражают дикариотическим мицелием CorloTus verslco or (Fr) Quel, таким же как применяли в примере 1, с по- . мощью платиновой петли, затем ведут выращивание при встряхивании в течение 7 дней при .

5 1 МП бульона,содержащего полученный таким образом мицелий, добавляют в среду, содержащую стеклянные бусы и ведут выращивание при встряхивании в течение б дней. Получен0 ный продукт дальше подвергают третьему опыту выращивания при встряхивании влечение 5 дней. Полученный при этом продукт мицелий не имеет скрепляющих соединений, он в 1,5 раза

5 шире, чем дикариотический мицелий, подсчет ядер по способу из примера 1 показал, что это монокариотический мицелий.

1 мл этого бульона инокулируют

П в 100 мл жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, и не содержащей стеклянных бус, .и культивируют при 25 ± .Концентрация мицелия через 3 дня после

начсша культивирования составляет

10,5 г/л, в то время как результат подобного выращивания дикариотического мицелия привел через 4 дня после начала культивирования к концентргщии всего 7 г/л.

О Пример 4. 100 мл жидкой

среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, загружают в коническую колбу на 500 мл эту среду после тепловой стерилизации инокули5 руют дикариотическим мицелием CorloCus versicotor (Fr) Que. из примера 1 с помощью платиновой петли затем ведут выращивание при встряхивании в тёчеиие 3 дней. После гомоге низации содержимое ферментатора накрывают полиэтиленовым мешком и герме тизируют от воздуха, затем культивируют в течение 4 дней. По окончании культивирования в атмосфере ферментатора содерзЕИТся 5,0% 1 МП бульона, содержащего полученный таким образом мицелий, инокулируют в среду по способу из первого опыта, затем ведут втррой. .опыт выращивания при вcтpяxивaнииV. как в n piBOM опыте. Такое культивит рование повторяют еще раза. В. результате определений проведенных как в примере 1, установлено, что весь полученный по этому способу мицелий представляет собой монокарв тический мицелий. Пример 5. Мицелий, получен ный из скошенной агаровой культуры Corlofus versicotor (Fr) Quef отбир ют дпя пробы и определяют качество ядер по методике, описанной в приме ре 1, при этом установлено, что вес мицелий представляют собой дикариот ческий мицелийJ отсутствует монокариотический мицелий. Это показыва ет, что полученный в этом опыте мицелий является дикариотическим ми целием. 100 мл жидкой среды,,содержащей 5% Глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, помещают в коническую колбу на 500 мл после тепловой стерилизации , затем инокулируют мицелием Corlotus verslcofor (Fr) Quel СМ-10 с помощью платиновой петли, затем ведут выращивание при встряхивании при 25 в течение 7 дней. Мицелий этйй культуры оказывается дикариотическим, концентрация составляет 10,8 г/л. Полученный таким образом дикарио тический мицелий инокулируют в коли честве 0,01% 20 л жидкой среды, в которой растворено 10% глюкозы и 1,5% дрожжевого экстракта, и ведут ,погружное выращивание при перемешивании в ферментаторе при 25 i с помощью лопастной мешалки при ско рости 500 .об/мин. После выращивания в течение 7 дней концентрация мицеЛИЯ в,бульоне составляет 10,2 г/л, 20 мл этого бульона вносят в такую же среду, второй опыт культивирования ведут при таких же условиях в течение б дней. Такое же культивиро вание еще повторяют в течение 5 дне в третьем опыте и в течение 4 дней в четвертом опыте. По окончании четвертого культивирования бульон находится в виде равномерной пульпы, концентрация мицелия в нем составляет 11,5 г/л. Мицелий не содержит сцепляющих соединений и весь представляет собой монокариотический мицелий. П р и м е р 6. Инокулируют в каждые 100. мл стерилизованной жидкой среды. Содержащей ингредиенты, соот-ветственно показанные в табл. 2 и сохраняемые каждая в 500,мл конической колбе, по 1 мл водной суспензии мицелия, приготовленного диспергированием мицелия .Cor I of us versicotor (Fr): Quef, .полученного при культивировании грибов в жидкой питательной среде, содержащий 3 вес.% глюкозы и О,5 вес.% экстракта дрожжей, при в течение 20 дней, разбавлении полученной таким образом культивированной культуры гриба 6/5-кратным объемом водного физиологического солевого раствора и измельчении смеси в смесителе в течение 3 мин при скорости 600 об/мин для получения гомогенизированной дисперсии мицелия грибов, в. которой не замечено мицелия в форме шариков и инокулированную питательную среду культивируют при встряхи вании при при перемешивании со скоростью 200 об/мин в течение 3 дней. Затем полученную таким образом культивированную среду эсептически переносят в смеситель емкостью 200 мл и подвергают измельчению при скорости 10000 об/мин в течение 10 мин. Измельченную таким образом питатеЛ ную среду снова пускаютна культивирование при 25 С в соот ветст;вующих атмосферных условиях. В этих опытах погружного культивирования при встряхивании было отмечено, что образование монокариотического мицелия протекает более интен-, сивно в случаях, когда аэральная фаза ферментера (в этих случаях колт бы) содержит другое количество кислорода, чем азота по сравнению со случаями, когда атмосфера не содержит количество кислорода, другого, чем количество азота, или в случае, когда атмосфера содержит слишком большое количество кислорода по сравнению с азотом. Концентра.ция 5- 20 об.%, предпочтительно 5-15 является подходящей для этой цели. Условия-.погружного культивирования при:встряхивании Cor)о Pus verstcoCor l-Fr) Quel представлены в табл. 2.

: Т а б л и ц а