Способ получения экстракта желчных кислот Советский патент 1979 года по МПК G01N33/16 

(54)

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ

Изобретение относится к области меди цины и касается получения желчных кисл из ткани печени. Известен способ получения экстракта желчных кислот из ткани печени путем гомогенизации ткани, экстракции этанолом при нш ревании, oчиoч: ки экстрактаЩ Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода и чистоты целевого продукта. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и степени очистки Цель достигается тем, что по предлагаемому способу экстракцию этанолом осуществляют в присутствии гидроокиси аммония, а очистку - смесью хлористого метилена и дистиллированной воды. Способ осуществляют следующим обра зом. Ткань печени весом в 1,0 г гомогенизируют в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 в соотношении 1:4. К 1 мл гомо- .гената добавляют 20 мл этанола и 0,1м 25%-ного раствора гидроксида аммония. Смесь помещают в ультратермостат на 15-2О мин при 50-6О С, Полученный экстракт фильтруют, к фильтрату добавляют 20 мл хлористого метилена и 15мл дистиллированной воды. Смесь встряхивают 2-3 мин и оставляют на ч при комнатной температуре. Полученная смесь имеет следующие объемньге соотмошения компонентов - этанол : гидроксид аммония : хлористый метилен : вода - 2:0,О1: :2:1,5, В течение этого времени смесь делится на две фракции, которые разделяют. Верхняя фракция состоит из этанола, гидроксида аммония и воды и содержит эстрагированные и очищенные желчные кислоты. Нижняя фракция содержит хлористый метилен с небольшой примесью этанола, в котором содержится незначительное количество желчных кислот, К этой фракции Добавляют 8 мл дистиллированной воды, встряхивают и оставляют на 3-4 ч при комнатной температуре. В течение некотороговремени смесь цополнительно разделяется на верхнюю и нижнюю фракции. Дополнительная верхняя фракция состоит из этанола и воцы и содержит желчные кислоты Эту фракцию жёлчных кислот присоединяют к ране полученной, Обищ1Й экстракт желчных кислот выпаривают досуха на вакуумном испарителе. Осадок растворяют в 0,3 мл бутанола, В осадке содержатся свободные и конъюгированные желчныекислоты. Качественное определение желчных кис лот осуществляют с помощью восходящей тонкослойной хроматографии на силикагеле. Для разделения желчных кислот исполь йуют систему растворителей следующего состава: 2,2,4 - триметилпентан, диизопропиловый эфир, уксусная кислота, изопропиловый йпирт, эТйЛенхлорид, вода в соитношении 2:1:1:1:1:0,26. Хроматографию прОводят на стеклянных пластинах размером 5Ох18 см, покрытых слоем силикагеля, толщина слоя О,25мм На пласти}су наносят 0,1 мл экстракта кислот, выделенного из ткани печени. Рядом с опытными образцами наносят 0,02 мл смеси стандартов желчны кислот в ко1щентрации 1 мг/мл. После разделения пластину высушивают на возДухе, затем опрыскивают 0,1%-ным раст вором концентрированной серной кислоты в 96 этаноле. Пятна желчных кислот идентифицируют в УФ-свете (360 мм). Для количественного определения содержания желчных кислот в тка}ш пече1ш методом спектрофлуориметрии участки пятен силикагеля с желчными кислотами (опытные и контрольные) снимают с пластины,, растворяют в 2 мл ковдентрированной серной кислоты, инкубируют в уЛБтратермостате в течение 1 ч при 6О Силикагель осаждают центрифугированием при 1500 . Надосадочная жидкость содержит желчные кислоты в концентрированной серной кислоте. Флуориметрню проводят при длине волны 470 мм. Количество желчных кислот в ткани печени вычисляют По формуле ЗоКс ч . р С где K(j- когщентрация желчных кислот в экстракте, рассчитанная в мкг на 1 г ткани пе чени| Эо- показания прибора при исследовании экстракта, мА;Л Kf,- концентрация я елчных кислот в стандартном растворе (20 мкг); Эд- показания прибора при исследовании стандартов желчных кислот, мА; Р - вес исследуемой печени, г. Предлагаемый способ обеспечивает высокий выход (до 91%) желчных кислот,, содержащих свободные и конъюгированные желчные кислоты, хорощо очищенные от липиднь х и других примесей. Способ может применяться для изучения процессов биосинтеза и обмена желчных кислот у ряда различных животных, а также у человека, и может сыграть большую роль в решении вопросов патогенеза поражений печени и в установле ши прогноза исходов поражений печени Формула изобретения Способ получения экстракта желчных кислот из ткаьш печени путем гомогенизации ткани, экстракции этанолом при нагревании, очистки экстракта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и степени оч -1стки, экстракцию этанолом осуществляют в присутствии гидроокиси аммония, а очистку - смесью хлористого метилена и дистиллированной воды. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.. l.bipids,1974, 9, 4, 294-297.