Олигодезоксирибонуклеотид в качестве универсального праймера для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера Советский патент 1991 года по МПК C07H21/04 C12Q1/68 

Изобретение относится к новому химическому соединению, конкретно к олмгоде- зоксирибонуклеотиду формулы

5 -d (G G Т G С G G G С С Т С Т Т С G С ,

О)

которое может быть использовано для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера.

Целью изобретения является получение нового олигодезоксирибонуклеотида, позволяющего увеличить разрешающую способность структурных гелей и упростить способ определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера,

Новый олигодезоксирибонуклеотид комплементарен (+}-цепи фагов М13 тр. Сайт отжига праймера расположен на расстоянии 120 нуклеотидов от области полилинкера (праймер - 120).

На чертеже приведена структурная формула.

П р и м е р 1. Синтез олигодезоксирибонуклеотида формулы (1),

Синтез олигодезоксирибонуклеотида проводят на трехколоночном полуавтоматическом синтезаторе, сконструированном на основе управляющего блока ВЭЖХ Attex и шес(иходовых кранов фосфитным методом, В синтез берут 15-20 мг носителя с посадкой первого звена. В качестве мономерных компонентов используют 53-0 и N-замещенные З -(М,М-диизопропила- мид)метилфосфиты нуклеозмдов. В качестве 5 -0-защитной группы применяют диметокситритильную группу. Для блокирования экзоциклических аминогрупп гетероциклических оснований цитидина и аденозина используют бензольную группу, для гуанозина - изобутирильную группу. В качестве твердофазного носителя применяют Силохром С80, содержащий аминопро- пильную группу (размер частиц 100-200 мкм, диаметр пор 400-600 А). Последовательность операций при присоединении каждого мономерного звена следующая: промывка - ацетонитрил (2 мл, 0,5 мин); детритилирование - 0,2 М трифтороуксус- ная кислота в дихлорэтане (2 мл, 0,7 мин); промывка - ацетонитрил (3 мл, 0,8 мин); конденсация - 0,1 М раствор мономера/0,5 М раствор тетразола в ацетонитриле (1/1, v/v, 0,15 мл, 3 мин), добавление нуклеотид- ного компонента и тетразола проводят вручную с помощью шприца; купирование - N-метилимидазол/пиридин/уксусный ангидрид/дихлорэтан (1/1/171, v/v, 0,5 мл, 0,5 мин); окисление - 1 %-ный раствор йода в смеси уксусной кислоты с пиридином (1 /9, v/v, 0,7 мл, 0,5 мин). После окончания синтеза проводят удаление защитных групп. Сначала удаляется диметокситритильная группа обработкой 0,2 М раствором трифто- роуксусной кислоты в дихлорэтане непосредственно в реакционной колонке. Затем полимер обрабатывают смесью тиофенол/триэтиламин/диоксан (1/1/3, v/v) для удаления 0-метильных защитных групп. Снятие олигодезоксирибонуклеотида с полимера и удаление N-ацильных защитных

групп проводят обработкой раствором аммиака С 8-30%) при 60°С в течение 12 ч. Носитель удаляют фильтрованием после охлаждения до 0°С. Фильтрат упаривают в вакуумном испарителе, растворяют в 200

мл воды. Очистку полностью деблокированного олигодезоксирибонуклеотида проводят в 20%-ном денатурирующем по- лиакриламидном геле с 7 М мочевиной в стеклянных пластинах (20-20 см). Электрофорез ведут при напряжении 600 В, В качестве электродного буфера используют 0,05 М трис-борат (рН 8,2), 1 мМ ЭДТА, После окончания электрофореза гель помещают на флуоресцентную пластину Siiufol UV-254,

зону.- содержащую олигонуклеотид, идентифицируют под источником УФ-излучения. Элюцию олигодезоксирибонуклеотида из вырезанной зоны полизкриламидного геля проводят в 200 мкл 12%-ного раствора перхлората натрия при 37°С в течение 12 ч, Олигодезоксирибонуклеотид осаждают 9 объемами ацетона и растворяют в воде до концентрации 0,5 о.ед/мл. Структуру синтезированного олигонуклеотида подтверждают секвенированием по методу МаксамаТмлберта.

П р и м е р 2. Использование олигсде- зоксирибонуклеотида формулы (1) в качестве праймера.

Радиоактивное мечение олигодезокси- рибонуклеотидов формулы (1) и известного формулы

0

5

0

5

5 -d(G TAAAACGACGGCCAG Т)-3 (2)

проводят в растворе общим объемом 5 мкл, содержащем 2-3 пМ праймера, 3 пМ CE-PJ-ATP (уд. активность 3000 Ки/мМ), 50 мМ трис-НС (рН 8,3), 35 мМ MgCIa и 0,1-1 ед, активности полинуклео- тидкиназы (37°С, 30 мин.). После добавления 7 мкл (2 мкг) фага М13 тр 10 с клонированным фрагментом - интерферона быка и 1 мкл буфера; 50 мМ трис-НС (рН 8,3), 35 мМ MgCte. проводят отжиг при 55°С 15 мин. Фаг с отожженным праймером разносят в микротитровальную плашку (по 3 мкл) в лунки с обозначениями G, А, Т, С, Затем в каждую лунку добавляют по 2 мкл соответствующих смесей dNTP/ddNTP (табл. 1) и 1 мкл (1 ед.акт.) фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 Е и инкубируют при 37°С 15 мин. После добавления 1 мкл раствора colli (2,5 мМ каждого) инкубируют при 37°С 15 мин. Затем добавляют по 3 мкл буфера

для нанесения (деионизованный формамид, бромфеноловый голубой, ксиленцианол), прогревают при 80°С 30 мин и 2-3 мкл каждой реакционной смеси разделяют в денатурирующем полиакриламидном геле. Продукты реакции по Сенгеру с использованием олигодезоксирибонуклеотида формулы (1) разделяют в обычном полиакриламидном геле, с использованием олигодезоксирибонуклеотида формулы (2) - в обычном и градиентном полиакриламидном гелях. Применяют гели толщиной 0,4 мм. Состав обычного денатурирующего по- лиакриламидного геля: акриламид5% (19:1, акриламидгбис-акриламид), мочевина 50%, Трис 130 мМ, борная кислота 40 мМ, ЭДТА 2,8 мМ, рН8,8.

Состав градиентного денатурирующего геля: акриламид 5% (19:1, акриламид:бис- акриламид), мочевина 50%, градиент буфера (1:2,5): от верхней части геля - 65 мМ Трис, 20 мМ борной кислоты, 1,4 мМ ЭДТА (рН 8,8) к нижней части геля - 325 мМ Трис, 100 мМ борной кислоты, 7 мМ ЭДТА, 10% сахарозы (рН 8,8).

Сравнительные характеристики результатов электрофореза приведены в табл. 2,

Электрофорез проводят при постоянном токе 30 мА с использованием металлической пластины для термостатирования. Как видно из табл. 2, разрешающая способность обычного геля с применением праймера (1) значительно превышает разрешающую способность геля с применением праймера (2) и сравнима с разрешающей способностью градиентного геля с использованием праймера (2).

Таким образом, использование изобретения позволяет увеличить разрешающую способность структурных гелей, что позволяет чтение с одного простого геля на клон

на 100-130 нуклеотидов больше и упростить способ определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера за счет исключения применения специальных методов.

Формула изобретения

Олигодезоксирибонуклеотид формулы

55-d(GGTGCGGGCCTCTTCGC П-З

в качестве универсального праймера для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгерз.

Изобретение касается нуклеотидов, в частности олигодёзоксирибонуклеотида формулы tf-dfG G Т G С G G G С С Т СТ Т С G С Т)-3 в качестве универсального прайме- ра для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера. Цель изобретения - создание нового праймера, позволяющего увеличить разрешающую способность структурных гелей и упростить определение первичной структуры ДНК по методу Сенгера. Синтез нового нуклеотида ведут на трехколоночном полуавтоматическом синтезаторе, сконструированном на основе управляемого блока ВЭЖХ Altex и 6-ходо- вых кранов фосфитным методом. В качестве носителя берут Счлохром С80, содержащий аминопропильную группу (размер частиц 100-200 мкм, диаметр пор 400-600 А), а качестве мономерных компонентов используют и N-замещенные 3 -{М,Г -дии- зопропиламид)метилфосфиты нуклеозидов. Для защиты берут диметокситритиль- ную группу, для блокирования экзоцикличе- ских аминогрупп цитидина и аденозина - бензоильную группу. На носитель сажают первое звено, а последовательность операций при присоединении каждого мономерного звена ведут известным путем с последующим снятием защитных групп известными приемами и определением структуры секвенированием по методу МзксамэТилберга. Новый нуклеотид комплементарен (+}-цепи фагов М13 тр, Сайт отжига праймера расположен на расстоянии 120 нуклеотидов от области полилинкера. Разрешающая способность обычного геля с применением данного праймера выше, чем с применением известного, и сравнима с разрешающей способностью градиентного геля с использованием известного праймера. Это позволяет вести чтение с одного простого геля на клон на 100-130 нуклеотидов больше и упрощает определение первичной структуры ДН К по методу Сенгера за счет исключения применения специальных методов. 1 ил., 2 табл. JWOTB Vs-,.. .raS XI

Таблица 1

Таблица 2

MISmpie

Hindi

Sna IAce I

SstIXmalXbal SailSphI

gATGATTACQMTTCGAGCTCGGTACCCGQGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT EcoRIKpnlBamH PstIHindi 11

TGACCQQCAQCAAAATG - 5 (-20)

GGCAL TGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGQAAAACCCCTGGCGTTACCCA-ACTTAATCGCC

TCGCTTCTCCGGGQGTGG - 5 (-120) TTGCAGCACATCCCCCTTTC6CCAGCTGGCGTAATAGCGMGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCC