Способ получения ингибиторов трипсина Советский патент 1979 года по МПК C12D13/00 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения ингибиторов трипсина, которые могут найти применение в медицинскик исследованиях. Известен способ получения ингибит ров трипсина путем выращивания культ ры-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и- минеральные соли, с последующим вьвделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости l . Однако продуценты, синтезирующие ингибиторы трипсина, используемые в известном способе, являются дефицитными. Целью изобретения является упрощение способа. Эта цель достигается тетл, что в качестве продуцента используют актиномицеты фиолетовой группы: Acttnomy ces vioEaceus confinug 2476 или Actinomyces vjoBaceua vicinus 1074, Actinomyces janlhinus 118 Act4nomyces vioEdroseas 25 или Act nomyces vioEatuS 1205. Способ поясняется следующими при мерами. Пример 1. Продуцент Act. janthinus 118 выращивают в течение двух суток в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 100 мл посевной среды, на. роторных качалках U80-200 об/минЗ при температуре 28±1°с:. Состав среды (г/л): крахмал картофельный - 10,, дрожжевой экстракт 10 мл, кукурузный экстракт - 10, NctCB - 2,0, рй 6,8-7,2. Затем посевной материал в количестве 10% переносят в колбы со 100 мл среды и культивирование продолжают еще 48 час на среде следувзщего состава (2/л) : бульон Хоттингера - 30 мл, пептон 5, глкжоза - 10,ЫО(СЕ - 5, рн 6,87,2, По истечение указанного срока фильтрат культуральной жидкости испытывают на ингибирующую активность по отношению к трипсину. Фильтрат (0,1 мл) подавляет протеолитическую активность трипсина на.70%. Биомассу удаляют фильтрованием на воронке Бюхнера, в фильтрат вносят сульфат аммония до 20%-ного насыщения. После нескольких час стояния при температуре раствор центрифугируют при 5000 д в течен.ие 10 мин., неактивный осадок отбрасЫ вают, а раствор вновь насыщают суль фатом до 0,4 и , оставляют на ночь при температуре 4°С; Отделенный центрифугированием осадок содержал всю ингибирующую активность. Ингиби ющук активность выражают в % ингиби рования активности трипсина и определяют следующим образом. Контроль № 1: в пробирки вног последовательно 0,2 мл раствора три сина (рабочий раствор содержит 0,1 мг/мл), 0,7 мл О, М раствора боратного буфера рН 7,4 и 1 мл го раствора казеина в том же буферу после чего инкубируют в течепие 30 мин при температуре 37°С, Контроль 2; в пробирки вносят последовательно 0,2 мл раствора три сина, 0,7 мл боратного буфера, 0,1м раствора ингибитора, .2 мл lOS-ного раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 2%-ного раствора казеина, В опытную пробу вносят 0,2 мл раствора трипсина, 0,7-мл боратного буфера и 0,1 мл раствора ингибитора смесь встряхивают и оставляют на 15 мин при комнатной температуре. По истечении этого времени в пробирки вносят 1,0 мл 2%-ного раствора казе на и инкубируют как и контроль Ml 30 мин при температуре . После термостатирования в пробирки с контр лем М 1 и в опытные пробы вносят по 2 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, в контроль № 1 добавляют 0,1 мл раствора ингибитора встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1. час. Осадки бел ков отфильтровывают, в фильтрате измеряют поглощение на спектрофотометре при 280 нм. Отношение разницы в поглощении контроля 1 и опыта к разнице в поглощении между контролем № 1 и контролем W 2, выраженное в процентах, есть единица ингибирования активности трипсина« Осадок, полученный после осаждения сульфатом аммония ,. Гзастворяют в минимальном количестве 0,005 М раствора трис-НСб буфера, рН 7,4 и после диализа проводят гель-хроматограф1ию на колонке с сефадексом Q 75, Выход активного материала контролируют измерением ингибирующей активности. В результате гель-хроматографии получают два пика, обладающие ингибирующей активностью. По скорости выхода из колонки активный материал имеет молекулярный йес 10-20 и 60-80 тысяч. Каждый из пиков сорбируют наДЕДЕ - Целлюлозе, уравновешенной 0,005 М трис-НС буфером, рН 7,4 и хроматографируют в градиенте NaCE (0-1,0 М),Фракции,проявляю.адие ингибирующую активность, собираю и после диализа против воды лиофилизируют. Пример 2, Культуру актиномицетата, относящегося к фиолетовой группе Act. viofiaceus сопЬпиз 2476 вырацдавают в условиях,указанных в примере 1, Фильтрат культуральной жидкости, обладающий ингибирующей активность, осаждают ацетоном при рН 5,0, Осадок отделяют центрифугированием, диализуют против 0,05 М К-фосфатного буфера, рН -7,5 и сорбируют на ДЕйЕ-целлюлозе. Ко- . лонку промывают тем же буфером до выхода активного пика и затем хроматографируют в градиенте КСЕ (0,0,8 М) до выхода второго пика, обладающего ингибируквдей активностью. Оба пика концентрируют, известными приемами (насыщение сульфатом, ультрафильтрация, осаждение ацетоном) и подвергают гель хроматографии на сефадексе Г-75, Активные по ингибирующей способности фракции собирают и лиофилизируют, П р и М е р 3, Актйномицеты, относящиеся к фиолетовой группе., например, Act. v оEOIсе us 1074, Act. vioPoroseus 25r Act. tus 1205, культивируют в условиях, описанных в примере 1, По истечении 72 часов фильтрат культуральной жидкости испытывают на ингибирующую активность по отношению к трипсину. Фильтрат культуральной жидкости (0,1 мл) в условиях опыта подавляет протеолитическую активность трипсина на 50-70%,, Ингибиторы трипсина имеют молекулярный вес 12-16 тысяч. Эти соединения не растворяются в органических растворителях, имеют характерный для белков УФ-спектр и по своей природе более близки природным ингибиторам трипсина, вваделенным из животных тканей, а также из растительных объектов, Пред;1агаемый способ обеспечивает расширение сырьевой базы для получения ингибиторов трипсина, тем самым упрощая его технологию получения и снижение себестоимости препарата, Формула изобретения . Способ получения ингибиторов трипсина путем выращивания культуры продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуралыюй жидкости, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве продуцента используют актиномицеты

5659610Q

фиолетовой группы: Actiriomyces vioPa-Источники информации, принятые

ceue 2476 или ActinomiJceB v oEa-во вииманив при экспертизе

свив 1074,Actinomuces jonthinus1 Итеглwr. Н Fii7i,mp ,ii,-t« t

iiS;Av;/.T// ii...