Способ получения полинуклеотидлигазы, индуцируемой фагом т4 в клетках Советский патент 1979 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДЛИГАЗЫ,

ИНДУЦИРУЕМОЙ ФАГОМ Т4 В КЛЕТКАХ

,ESCHERiCHiA .3 На отсутствие экзонуклеаз указывает полное сохранение концевой дезоксинурслеотидной последоватепьности при длительных кнкубациях (60 час) больших количеств фермента с ДНК. Препарат фермента совершенно свободен от эндонуклеаз, не понижает уров ня биологической активности ДНК при трансфекцйи. Пример . E.coEi В выращивают до титра бактериальных тел в мл при 21°с с интенсивной аэрацией на среде следующего состава (г на 1 л): МН4Се -1, MgSO - 0,13, 3, 6, глюкоза - 4,. казаминовые кислоты - 2. Заражают фагом Т4ат W 82 с шoжecтвeннQCтью фаговых частиц на клетку и продолжают выращивание в течение 1,5-2 час Зараженные клетки собирают центрифугированием. Все дальнейшие операции «проводят на холоду (0- +5°С) , во всех буферных растворах присутствует lOm-M трис-Нсе рН 7,5 и 10птМ-2-меркаптоэтаиола (А), Клетки (100 г) дезинтегрируют:, белки экстрагируют буфером Л и освобождают экстракт от разрушенных клеточных .стенок цен рифугированием. Экстракт осаждают 0,6-0,7% сульфатом стрептомицина, центрифугируют. Осадок отбрасьшают. Супернатант осаждают сульфатом аммо ния при 30% насыщения. Осадок -отбра сывают, Супернатант осаждают, довод концентрацию сульфата аммония до 55% насыщения. Осадок растворяют в буфере Ас 0,1 М NaCE и диализую против буфера А. Посадку на соединенные последова тельно колонки с ДЕАЕ-целлюЛозой (100 мл) и фосфоцеллюлозой (50 мл) проводят в буфере с 0,2 М NaC т.е. в условиях, когда фермент связьшает ся лишь со вropы -I ионообменником. (фосфоцеллюлозой), и элюируют, ступенчато повышая концентрацию NaCB., Фракции элюата, содержащие ДНК-лигазу, диаЛизуютпротив буфера А в те чениеночй. 3aTeivi проводят хроматографию на совмещенных колонках с ДЕАЕ-целлюлозой (100 шх) и 10 мг ,Д1Ж 44 агарозой (однонитевая ДНК, выплавленная в агарозу). Элюацию проводят радиентом ко{:1центрации NaCe в буфере А сразу с обоих сорбентов. Применение ионообменников в такой последовательности позволяет резко сократить их объем, ДНК-агароза прочно связывает многие нуклеазы и эффективно очищает препарат фермента. Элюат, содержащий ДНК-лигазу, концентрируют с помощью колонки гидроксилаппатита (1-2мл) или переосаяуцают сульфатом аммония. Полученный препарат фермента диализуют против 60%-ного глицерина в буферном растворе А. Предлагаемыйспособ позволяет получить препарат фермента с 10-15% выходом. Препарат фермента имеет 15000 ед/мг белка и свободен от нуклеаз. -Сокращено число операций и время выделения за счет соединенных колонок в определенной последовательности. Формула изобретения СпосЬб получения полинуклеотидлигазы, индуцируемой фагом Т4 в клетках E5Cheг ch a CoSi , предусматривающий заражение клеток фагом, дезинтеграцию клеток, экстракцию, центрифугирование экстракта с последующим осаждением сульфатом стрептомицина, а затем сульфатом аммония, диализом и хроматографией -раствора, содержащего фермент по окончанию которой раствор концентрируют с помощью колонки гидроксилаппатита, о т л и Чающийся тем, что, с целью повЕлиения выхода фермента, степени очистки и упрощения процесса, хроматографию проводят сначала на соединенных последовательно колонках с ДЕАЕ-целлюлозой .и фосфоцеллюлоъой, а затем на колонках q ДЕАЕ-целлюлозой и ДНК-агарозой. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Biochembtpu 1973, 12, р.5045.:.