Способ получения модифицированных ферментов Советский патент 1979 года по МПК A61K38/43 

. Изобретение относится к области биохимии, а именно к способу получения модифицированных ферментов и может использоваться для пс-лучения ферментов, модифицированнь х как растворимыми, так и HepacTBOpHNSiMH, солями диаэония, в частности для получения ферментов,связанных с растворимыми носителями и иммобилизованных при помощи реакции азосочетания. Иммобилизованные ферменты могут использоваться в качестве катализаторов в химической промышленности в реакторах проточного типа, а ферменты, связанные с растворимыми носителями помимо использования в качестве катализаторов в химической промышленност могут применяться как биологически активные вещества и лекарственные препараты,

В литературе описаны способы модификации ферментов путем ковалентного связывания их с растворимыми и нерастворимыми носителями (матрицами).

С этой целью особенно широко используют способы ковалентного связывания ферментов с различными носителями при помощи реакций ацилирования (алкилирования), при помощи изоцианатных (изотпоцианатных) групп, галондциана, цианурхлорида и его производных или реакции азосочетания 1 .

Связывание фермента с носителем осуществляется, практически всегда, через аминогруппу диаминомонокарбоновых аьжнокислот. Исключение составляOет метод азосочетания, используя который можно осуществить связывание через амино-, сульфгидрильиые-,. циклические и гетероциклические группы аминокислот. Эта особенность реакции азосочетания дает возможность осуще5ствлять связывание ферментов через значительно большее количество точек, по сравнению со способами, в основе которых лежат узко специфические реакции на аминогруппы белков, Многото0чечность связывания, как известно, положительно коррелирует со стабиль-ностью связанных ферментов. Недостатком метода азосочетания является его. во многих случаях, низкая эффектив5 .ность, определяемая количеством связанного с матрицей (носителем-) фермента..

Известен способ модификации ферментов, включающий получение солей диазония из соединений, содержащих

0

аминоакрильные группы г путем коваленого связывания их с нерастворимой солью диаэония на основе п-аминобензилцеллюлозы 2.

Обработкой азотистой кислотой (или раствором нитрита натрия в солной кислоте) аминобензилцеллюлоза превращается в соль диазония, к коуорой добавляется растворенный в буфере фермент. После перемешивания и удаления из. суспензии промыванием не модифицированного (не связавшегося с солью диазония) фермента определяется выход конечного продукта. Выход модифицированной РНКазы и химотрипсина составляет 2,3% и 3,4% соответственно. Столь низкий выход обеспечивает упоминавшееся выше достоинство метода азосочетания, позволяющее осуществлять многоточечное связывание фермента с носителем

Цель изобретения - разработка способа модификации ферментов ковалентным связыванием с растворимыми и нерастворимыми солями диазония, позволяющего добиться большого выхода модифицированных ферментов.

Это достигается тем, что в процессе модификации ферментов солями Д11.;.зония в реакционную смесь добавляют катализатор - акцептор протонов, обычно пиридин, триэтиламин, диэтиламин, или четвертичное аммониевое основание в конечной, концентрации 0,15-5%.

Пррцесс проводят следующим .

Растворимые или нерастворимые соли диазония, например декстраны или соответственно целлюлозу, активированные введением в них а иноарильных ра-дикалов, обрабатывают раствором NaNO в соляной кислоте при температуре О-(+2°С). рН образовавшегося раствора полимерной соли диазония или суспензииf в случае нерастворимого носителя, доводят до 3-4, Ферменты растворяют в буфере и.добавляют к-раствору акцептор протонов или четвертичное аммониевое основание. Смесь фермен с катализатором добавляют при перемешивании к соли диазония и оставляют на 10-14 ч. Конечная концентрция катализатора -в реакционной смеси 0,15-5%, Ковалентно связанные ферменты в необходимых случаях отдляют от несвязавшихся ферментов и акцептора протонов любым доступным Методом (растворимые ковалентно связанные ферменты, например, при помощи гель-фильтрации или ионного обмена и т.д.; нерастворимые - центрифугированием, фильтрованием и др.) .

Получение модифицированного фермента в присутствии катализатора в 5-10 раз увеличивает выход связаного фермента по белку и в 4-7 раз по активности. Это, несомненно, увеличивает экономическую эффективность связывания ферментов с носителями при Помощи азосочетания. Увеличение выхода связанных ферментов предлагаемым способом позволяет широко использовать его вместо методов ковалентного связывания, основанных на узкоспецифических реакциях. При этом с большим выходом вязможно получение ферментов, связанных с носителем наибольшим количеством точек связывания, т.е. наиболее стабильных и, следовательно, экономически наиболее выгодных.

Пример 1. Получение рибо.нуклеазы, ковалентно связанной с растворимой солью диазония (с растворимым м-аминобензилоксиметилдекстраном).

11 г м-аминобензилоксиметилдекстрана растворяют в 100 мл 0,5 НСЕ охлаждают до О-2°С и добавляют 400 мг NaNO2 Диазотируют 5 мин, подщелачивают 3,5 н. NaOH до рН 4,0 и к диазотированному полисахариду добавляют 1 г панкреатической рибонуклеазы, растворенной в 75 мл О,4 М буфера трис-НСе рН 8,5, содержащего 0,33% пиридина. Смесь оставляют на 14-16 ч. Несвязанный фермент и пиридин отделяют от продукта реакции при помощи гель-фильтрации на сефадексе G - 75 в системе 0,2 М NaCf.

Выход связанной рибонуклеазы по белку 98%; по активности 30%.

Пример 2. Получение рибонуклеазы, ковалентно связанной с нерастворимой солью диазония (с м-аминобензилоксиметилцеллюлозой). К 0,1 г м аминобензилоксиметил- целлюлозы в 4 мл О,5 н. НС6 при . постоянном перемешивании, добавляли 0,С04 г NaNO (0-2°С). Диазотируют 5 мкн, подщелачивают 3,5 н, NaOH до рН 4,0 и к диазотированной целглолозе добавляли 0,1 г панкреатической рибонуклеазы-, растворенной в 10 мл 0,2 М боратного буфера рН 8,5 содержащего 0,26% пиридина. Смесь перемешивают в течение 14-16 ч и затем несвязанный фермент и пиридин отмывают на фильтре М NaC6

Выход модифицированной (иммобилизованной) рибонуклеазы по белку 50%;по активности 22%.

При проведении связывания рибонуклеазы в аналогичных условиях, но в отсутствии катализаторов, получают следующие результаты.

При связывании рибонуклеаз.ы с растворимым м-аминобензилоксиметилдекстраном выход модифи-цированного фермента по белку 20% (по активности 8-10%).

При связывании рибонуклеазы с 5 м-аминобензилоксиметилцеллюлозой

выход модифицированного фермента по белку 5%, по активности 3%.

Пример 3. Получение связанной рибонуклеазы в присутствии диэтиламина.v

Условия связывания и соотношение реактивов те же, что в примере 1. Э качестве катализатора используют диэтиламин конечной концентрации 0,2%, рН реакционной смеси 8,5.

Выход связанной рибонуклеазы по белку 60%, по активности 25%.

Пример 4. Получение связанной рибонуклеазы в присутствии триэтиламина.

Условия связывания и соотношение реактивов те же, что в примере 1. В качестве катализатора используют триэтиламин конечной концентрации 0,2%. рН реакционной смеси 8,5.

Выход связанной рибонуклеазы по белку 90%, по активности 28%.

Пример 5. Получение связанной рибонуклеазы в присутствии четвертичного аммониевого основания.

Условия связывания и соотношение реактивов те же, что в примере 1. В качестве катализатора используют четвертичное аммониевое основание конечной концентрации 0,2%, рН реакционной смеси 8,5,

Выход связанной рибонуклеазы по белку 65%, по активности 24%.

.Пример 6. определение верхнего и нижнего пределов концентраций пиридина, катализирующего модификацию рибонуклеазы реакцией азосочетания.

Определение проводят сравнением входа модифицированного продукта в реакции модификации фермента диазотированным м-аминобензиловым спиртом в зависимости от концентрации ктализатора.

3 мг м-аминобензилового спирта растворяют в 0,5 мл 0,5 н. НСВ, диазотировали на холоду в течение 5 ми добавлением эквивалентного количества NaNO. Затем смесь подщелачивают до рН 4 3,5 н. раствором NaOH и приливают к 5 мг рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,2 М трис-нее-буфера рН 8,5 с пиридином различной концентрации или без него (в контроле). Через определенные промежутки времени 10, 20 и 30 мин из реакционной , смеси отбирают аликвоты по О,2 мл и приливают к 5 мл 0,2% раствора азида Na в 0,5 н. NaOH.

Выход модифицированного фермента определяют по разнице оптической плотности образцов при 350 нм модифицированных с катализатором и в его отсутствии,

В табл.1 дана зависимость выхода модифицированной рибонуклеазы от коцентрации пиридина.

10

15

Примечание. Выход модифицированной рибонуклеазы в отсутствии пиридина принятза

100%.

Таким образом, нижний и верхний пределы концентрации пиридина, ка- тализирующие реакцию азосочетания равняются .соответственно 0,15-5,0%.

Пример 7. Влияние пиридина на модификацию различных ферментов реакцией азосочетания.

Панкреатическую рибонуклеазу, трипсин и химотрипсин подвергали модификации диазотированным м-аминобензи.7 ловым спиртом в присутствии катализатора и без него.

а). 3 мг м-аминобензилового спирта растворяют в 0,5 мл 0,5 н. НСЕ,. диазотируют на холоду в течение 5 мин добавлением эквивалентного количества NaNO Затем смесь подщелачивают до рН 4 3,5 н. раствором NaOH и приливают к 5 мг панкреатической рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,2 М трис-НСе-буфера рН 8,5 с пиридином и без него. Конечная концентрация пиридина 1%. Через 20 мин из реакционной смеси отбирают аликвоты по 0,2 мл и приливают к 5 мл 0,2% раствора азида натрия в 0,5N NaOH.

Выход модифицированного фермента определяют по разнице оптической

плотности образцов при 350 нм, модифицированных с катализатором и без него.

б). Условия проведения, количество соотношение реактивов в реакции одификации аналогичны описанным в ункте а) для панкреатической рибоуклеазы за исключением того, что в качестве азосоставляющей нспользова и трипсин.

в). Условия проведения, количество и соотношение реактивов в реакции модификации аналогичны описанным в пункте а) для панкреатической рибонуклеазы, за исключением того, что в качестве азосоставляющей использовали химотрипсин.

В табл.2 отражено влияние пиридина на модификацию различных ферментов диазотированным м-аминобензиловы,м спиртом. .

{

Т а б л н Ц а 2

Выход модифицированног с катализатором фермента,% t 20 мин

122 118 120

Выход модифиие. цированных без катализатора ферментов принят за 100%.

Формула изобретения

1.Способ получения модифицированных ферментов, включающий получение солей диазония из соединений, содержащих аминоарильные группы, их об- . работку раствором нитрита натрия в кислой среде и взаимодействие полученных селей диазония с ферментами, отличающийся тем, что,

с целью увеличения выхода продукта, взаимодействие фермейта с солью диазония осуществляют в присутствии катализатора - акцептора протонов или четвертичного аммониевого основания в конечной концентрации 0,15 - 5%. .

2.Способ по П.1, отлича ющ и и с я тем, что в качестве катализатора акцептора протонов используют пиридин, диэтиламин или триэтиламин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспектива т.т. 1, 2, под ред. Березина И.В., Антонова В.К./ Мартйнека К. Изд-во Московского .университета, 1966.

2.Mitz А., Sununaria L,3., Synthesis of biologically active cellulose derivatives Nature 189, 576, 1961 (прототип).