Способ получения антибактериального вещества Советский патент 1979 года по МПК C12D13/00 

3 6 среда представляет собой смесь соевой муки ( (во( ), высу- . шенных растворимых на основе винокуренного солода { ScotasoC ) и Лёкстрина. Добавление пеноудаляющих агентов, таких как РЕцгошс L 81 может быть необходимым для контролирования пено рбраэования некоторых сред в ферментаторах./ В среды можно добавлять минеральные соли, такие как NaCC , ксе, MgCej InCl2 I FeCe I Na2&O4 , FeS04 , ,. , a также натриевые и калиевыесоли фосфорной кислоты,- СаСО можно добавлять в качестЕ-е источника ионов Са , в качестве микроэлементов, таких как никель, кобальт или марганец можно добавлять их соли, по желанию в смесь могут быть добавлены витамины.. Культивирование Streptom jces etaNuEigerue проводят при 15-40 С,обыч но при 20-35 0 и при рН 5-8,5, предпочтительно 6-7,5. Strepiom jces ctavutigerus культивщэуют в среде в стеклянных конических колбах, которые продувают воздухом в результате встряхивания на ротационном аппарате для встр хивания или в ферментаторе из нержа веющей стали с отбойными перегородками при перемешивании с помощью турбинной мешалки с лопастными диск ми и при аэрации с помощью разбрызгивания. Ферментацию можно также ос ществлять непрерывным способом. Начальный рН ферментации обычно составляет 7,О и максимальный выход антибактериального вещества (клавулановой кислоты) получают за 2-10 дней при 20-35С. Клавулановую кислоту экстрагируют из филйтрата разлйчньлми способамй. Экстракцию с помощью растворителя и холодного экстракта культуры, в которой рН регулируется так, чтобы Иметь значения в кислой области шка лы, проводят на анионообменных смолах. Клетки Streptom(ces cEavuBigeros обычно вначале удаляют из ферментатора в результате фильтрации или центрифугирования перед тем, как начинают процедуру экстракции. Для экстракции используют раство ритель, фильтра культуры охлаада ют и рН понижают до 2-3 в результат добавления кислоты при интенсивном перемешивании с несмешивающимся с в дои органическим растворителем, так как н - бутклацетат,- метилизобутилкетон, н-бутанол или этилацетат. Кислота, которая используется дл понижения рН среды, обычно поедстав ляет собой минеральную кислоту, такую как хлористоводородная, серная, азотная, фосфорная. н-Бутанол является наиболее применимым растворите лем для использования При экстракции подкисленного фильтрата культуры. После разделения фаз в результате центрифугирования р -лактамазаингибирующий метаболит экстрагируется из фазы растворителя в водный раствор бикарбоната натрия или вторичный кислый фосфат калия (бу- . фер), суспензию СаСО, или воду, при этом рН поддерживается практически на нейтральном уровне, например равным 7,0. Этот водный экстракт после раз-, деления фаз может быть сконцентрирован при пониженном давлении и высушен на холоду с образованием, сырого продукта, представляющего собой соль клавулановой кислотц. Такой продукт является устойчивым при хранении в сухом твердом сбстоянии при -20с. Можно использовать еще один экстракционный способ, который заключа- . ется в контактировании фильтрата культуры {обычно при нейтральном рН), ; содержащего соль клавулановой кислоты, с органической фазой, в которой растворяется нерастворимый в воде амин. Подходящие для этих целей растворители включают такие несмешивающиеся с водой полярные растворители, как метилизобутилке он, трихлорэтилен и т.п. Подходящие амины включают вторичные или третичные амины, в которых одна из замещающих групп представляет собой алифатическую группу с длинной цепью, например, из 12-16 углеродных атомов, а другая группа представляет собой третич.ную арилалкильную группу, в результате чего молекула оказывается липофильной. Amber&-ite LAU является наиболее пригодным амином. Как правило, амин используется как кислая соль присоединения. После такого способа экстракции клавулановая кислота присутствует в органической фазе в виде соли амина. Затем органическую фазу отделяют от фильтрата культуры. Клавулановая кислота может экстрагироваться обратно в водную фазу в результате обратной экстракции раствором соли, предпочтительно концентрированным раствором хлористого натрия, аз1ртнокислого натрия и т.п. Сырая соль клавулано-j вой кислоты может быть затем получена в результате сушки на холоду. Другие способы выделения, которые могут быть использованы, это адсорбция на угле, осаждение, высаливание и молекулярная фильтрация, однако они обычно оказываются не эффективными. . Дальнейшую очистку сырых твердых веществ можно осуществлять многими способами, однакоионо-обменная колонная -хроматография представляет собой очень эффективный способ, особе нно при использовании Osopor de AcicJite FHP SPA 64 или DEAE целлюлозы, колонка с De Acidite ложет представлять собой градиент, ко торый элюирует водным раствором соли такой как например хлористь;П натрий (О - 0,5 моль) / Колонку с DEAE целлю лозой в фосфатном буфере fO,Ol м) при рН.7 можно йлюировать раствором соли; обычно раствором МаСЕ (0,02 М) В фосфатном буфере (0,01 М) при рН 7 Активные фракции можно детектировать по их fi -лактамазаингибирующей акти ности и их антибактерицидной активно ти В отношении KCebsietta aerog enes в.результате проведения испытания на диффузионном агаре. Фракции, содержащие основную массу с такой активностью, затем объединяют и ко.нцентри рук)т до небольшого объема в вакууме. Сырой препарат соли клавулановоЯ кис лоты затем обессоливают путем пропус кания через адсорбирующий слой Вто Get Р 2. Активный обессоленный материал концентрируют, смешивают с этанолом и подвергают дополнительному хроматографированию на колонке с целлюлозой с использованием в качест ве растворителя верхней фазы бутанол - этанол -вода в соотношении 4:1:5. . Фракции, содержащие вещество, которое ингибирует fb-лактамазу, вырабатываемую Esctief Ichia coEi, сме шивают, выпаривают досуха в вакууме, повторно растворяют в воде и сушат на холоду с образованием соли клавулановой кислоты в виде белого твердого вещества. . Способы, которые являются наиболее эффективными при детектировании клавулановой кислоты в фильтратам культуры, представляют собой бумажную хроматографию и биоаутографическую детекционную систему. Тонкослойная хроматографияможет использовать ся для определения клавулановой кислоты в твердых препаратах. Способ получения клавулановой кислоты Или ее соли в числом виде включает выделение загр 5зненноя формы клавулановой кислоты или ее солей , образование эфира клавулановой кислоты согласно известной методике очистку эфира -и дальнейшую регенерацию клавулановой кислоты или ее Соли из эфира. Загрязненная клавулановая кислота ее соли обычно содержат до 1 вес.% антибиотика. Пример 1 . StreptoiTTace% ctaVиtigeгu;, культивируют при на срезах агара, содержащих 1 вес.% дрожжевого экстракта, 1 вес.% глюкозы и 2 вес.% оксоидного агара 3, рН 6,8. Для переноса мицелия м спор со среза в 100 мл жидкой среды, находящейся в эрленмейеровских колбах на 500мл используют стерильную лопатку. Жидкая среда имеет следующий состав, г/л: Солодовый экстракт 10 Бактериологический пептон 10 Глицерин20 Водопроводная вода Остальное Среду поддерживают при рН 7,0 с помощью раствора гидроокиси натрия, разливают в колбы по 100 мл, которые закупоривают пластиковыми пробками перед тем на 20 мин. Инокулированную засеянную колбу встряхивают в тече.ние 3 дней при 26°С на ротационной трясучке со скоростью порядка 240 об/мин. Колбы, для получения, содержащие жидкую среду, инокулируют 5 вес.% вегета ивным прививочным материалом и прорастание осуществляют в тех же условиях,что и в колбе с.посевом. Образцы фильтрата,культуры проверя|6т на ингибиторное действие против ;4-лактамазы, вырабатываемой Eschenictiici coEi аТ4. Оптимальная активность достигается черрз 3 дня. Результаты представлены в табл. 1. Зона клавулановой кислоты R f 0,46 обнаруживается при ис.следовании фильтрата культуры методом бумажкой хроматографии. Strepiomyce& cEdvuEigfefu также повергают культивированию в двухлитровой колбе для встряхивания; содержащей 400 мл среды (стадия по лучения), при использовании такой же среды и услов-ий культурирования, ; как описано выще. В этих более крупных сосудах рост организма происходит более медленно и оптимальная j3 -лактамазаингибирующая активность достигается- через 7-9 дней инокуляций вегетативным прививочньт- материалом. Результаты также представлены в табл. i.

-Лактамаэная ингибирующая активность разновидности Streptom ces cf.avutigepus, растущей в колбах на 500.МЛ ( 1 ) и 2000 мл ТП) .

Таблица

1 2 3

)

Конечное разбавление фильтрата 1/2500 П р и м е р 2. Культивирование Sireptotnscea ctavutigferus. . колбу для посева, подготовленйую согласно примеру 1, используют для инокулирования конических колб на 500 мл, содержащих 100 мл алйквоты описанной ниже среды в деионизированной воде г вес,% Растворимый крахмал 2 Глицерин0,3 Скотазол ,,1 Ар1 авоч1 Среду подвергают стерилизации в автоклаве в течение 20 мин и инокулйруют путем добавления 5 вес.% вегв ативного прививочного Ме териала. КёлбЫ встряхивают при 26°С на ротационной трясучке , как описано в при мере 1. Оптимальный титр клавуланб,вЬй кислоты достигается к 3-5 дням. Разбавление фильтрата культуры в со отношении 1/2500 дает 60%-иое ингибирование в пробе на ингибироварие |Ь - лактамазы. Зона клавулановрй кислоты обнаруживалась при Rf 0,46 при использовании метода бумажной хроматографии. Эта зона увеличивает Си в рйэмере параллельно с увеличен ем активности в пробе на определени ингибирования р-лактамазы. П РИМ ер 3. Колбу для кульTViaj посевного материала согласно примеру 1 используют для инокулироваиия криических колб на 500 мл, со держасцих 100 мл алйквоты приведенно HHJKe , вес.%: Декстрин2 Аркасой1 Скотазол0,1 reSQ 7HjO0,01

15 30 55 приготовленной в деиониэированной воде и стерилизованной. Содержание прививочного материала составляет 5%. Инокулированные колбы встряхивают при 26°С. Оптимальная 5-лактамаэаингибирующая активность достигается за 3-5 дней. Эта активность аналогична активности в примере 2. И р и м ер 4. Культивирование Streptomijces c avu6ig-erua. Прививочную стадию, описанную в примере 1, используют для инокулирования конических колб на 500 мл, содержащих следующую среду, приготовленную в деионизированной воде, вес.%: Декстроза1 Соерая мука1 Скотазол 0,05 CaCOj1 Эти колбы обрабатывают точно таким же способом, как описано в предшествующих примерах, и культивируют при идентичных условиях. р-Лактамазаингибитррная активность достигается за 3-5 дней. Фильтрат культуры при конечном разбавлении 1/2500 дает 35-45%-ное ингибирование в пробе на определение р -лактамазаингибиторной активности. П р и м е р 5. Культивирование Strepiorrfaces ctavufcigfer-us i-Лактамазаингибиторную активность получают при использовании приведенной ниже среды, вес.%: Глицерин1 Соевая мука1,5 MgSO40,1 К2НР04Ol при осуществлении стадии прививки в условиях культивирования аналогичны примеру 1. П ри м е р 6. Культивирование Streptom-sces ctavutigerus Следующую среду используют для получения клавулановой кислоты при использовании таких же условий и ве гетативного прививочного материала что описаны в примере 1, вес.%: Глюкоза Lab. Lenico Оксидный дрожжевой экстракт CaCOj Среду готовят в деионизированной воде. Оптимальные титры достигают за 3-5 дней и разбавление фильтр ГЙ ку туры в соотношении 1/2500 дает 35-45%-ное ингибирование в пробе на определение ингибирования (Ъ-лакта мазногЬ энзима.. Пример 7. Культивирование Streptomvces ctavutligeru Аналогично примерам 4, 5 и б при веденная ниже среда, вес.%: Глюкоза Аркасой 0,02 СаСО} 0,0001 СоС1„ дает 35-45%-ное ингибирование (разбавление 1/2500) в р-лактамазной пробе при оптимальном титре, которы дбстигается. через 3-5 дней после инокулирования. Пример 8. Культивирование StreptomyceS ctavuEigerusОписанная ниже среда для стадии получения, при ее использовании в стандартных условиях культивации, аналогичных описанным в предыдущих примерах дает 2Ь-30%-ное ингибирова ние при 1/2500 разбавлении в опыте на Ь-лактамазу за 3-5 дней после инокуляции. При использовании метода бумажной хроматографии зона кла вулановой кислоты. - Rf 0,46 при исследовании фильтрата культуры. Среда, вес.%: Скотаэол: 2 . Оксоидный дрожжевой экстракт1 Среду готовят в водопроводной во де, рН 7,О. .Пример 9. Культивирование Streptomiices ctavutigrerusПри стандартных условиях культи вации при использовании приведенно ниже среды получают клавулановую к лоту через 3-5 дней после инокулир ван-ия вегетативным прививочным материалом. Разбавление культуры в с отношении 1/2500 приводит к 20-30% ному ингибированию в пробе на инги бирование -лактс1м зы. Среда, г/л: Глицерин15 Сахароза20 Пролин2,5 Мононатрий глутамат 1,5 NciCE5,0 KjHPO 2,0 Mnce.4H200,1 Fece бНгО . 0,1 ZnCCj 0,05 MgfSO TH O1,0 Среду готовят в деионизированной воде рН 7,1. Пример 10; Культивирование Sireptomvces cE.av(jeig-eru%. Для получения посевного материала выращивают культуру на косом агаре в склянке ROUX , инкубацию проводят при 26°С в течение 10 дней. После инкубации добавляют 100 мл стерильной воды и получают суспензию мицелия. Эту суспензию используют для инокулирования 50 л стерилизованной прививочной среды следующего ниже состава в водопроводной воде, вес.%: Оксоидный солодовый экстракт1 Оксоидный бактериологический пептон - 1 Глицерин1 10% пеногаситель P urpnic U 81 в соевом масле 0,05 Среду помещают а девяностолитровый ферментатор из нержавеющей стали и перемешивают с помощью лопастной, дисковой.или центробежной мешалки со скоростью 240 об/мин. Стерильный воздух подают со скоростью 50 л/мин и инкубацию проводят при 26С. Через 72 ч прививочный ферментатор используют для инокулирования 150 л этой же среды, вводя ее стерильно в соотноше:гни 5% (об./об.). Эту на стадии получения помещают в трехсбтлитровый стсшьной ферментатор, приводимый во вращение с помощью дискового центробежного смесителя при скорости враицения 210 об./ /мин. Стерильный воздух подают со скоростью 150 л/мий. Ферментацию проводят по 10 мл (10% P8uronic L 81 в соевом масле).Через определенные интервалы отбирают образцы для анализа на ингибирование -лактамазы. Ферментатор разгружают через 4-5 дней при оптима тьном уровне (Ъ-лактамазной ингибиторной активности. В табл. 2 предс тавлена %-лактамазная ингибиторная активность образцов филырата культуры, взятых из. трехсотлитрового ферментатора, содержащего Streptom ces ctavutigerus.

ji-Лактамазная ингибиторная активность образцов фильтрата культуры, взятых из трехсотлитрового ферментатора.

ферментации,

Ингибирование в пробе на ингидни ; бирование р-лактама5ы при конечном разбавлении порядка 1/2500, % .- П ibH м е р li. Культивация Streptunidceb cEotvuEig-epuS. -. Опыт проводят в прививочном ферм таторе точно таким же образом, как описано в ;примере 10,- при использо ванйи тойже среды. . . V Через; 62 ч содержимое прививочног фериёнта Ьра,, представляющее 5% (об/об.) вегетативного прививочного МДтер:й 1;ла, перейосят в трехсотлитровы фермен 1атор йЗнержавеющей стали, сЬдер сащйй- 150 л стерйлизованнОй сре дьа, при: пе рёмё11аеяии с помощью дрскового центробежного смесителя при скорости вращения 210 об/мин.Стерил ный вО-ЭйУх подают со скОростью 150 л/мйй. Ферментацию проводят при 26 С Антипенный агент при .необходимости д:оба:вляюг ПОЕ1ЦИЯМЙ по 10 мл (10% Pturonic L- 81 в соевом масле) . .СреДа, используемая на стадии получения,представляет собой такую же реду; что и в примере 3 и в нее перед стерилизацией добавляют О,05%(об об.) антипенного агента, представляrofijerp собой смесь 10% PturonicU 81 И соевого масла. 1Ь -Лактамазная ингибирующая ак тивность образцов ферментации аналогична образцам из примера 10 (см. табл. 2). Бумажнохроматографическое йсслеяо зание обнаруживает зону клавулановой кислоты при Rf 0,46 при использовании ранее описанного биоав тографического (синергетического) сп соба. Размер зоны, соответствующей клавулановой кислоте ;увеличивается параллельно увеличению ингибировани }i -лактамазы.

Таблица 2 Пример 12. Культивирование btreptomyces oEavubigerus. 100 мл стерильной вода добавляют к спорообразующей культуре, которая прорастает на агаре Bennets в течение 10 дней при 2б°С. Готовят суспензию мицелия и спор, которую используют для инокуляции 75 л/стерилизованной среды следующего состава в водопроводной воде, вес.%: Декстрин , 2 Аркасой 1 10% РЕигошс 1,81 в соевом масле 0,03 рН среда поддерживают при7,О Среду помещают в столитровый ментатор, который приводится вО вращение дисковой центробежной мёшалкОй со скоростью вращения 140 об./мин. СТериальный воздух подают соскоростью 75 л/мин и сосуд инкубируют в течение 72ч при 26°С. . - . Содержимое прививочного ферментатора используют для инокулирования 1500 л стерилизованной средда следующего ниже состава в водопроводной воде, вес.%: Аркасой 501/5 Глицерин,1,0 КН2Р04 .0,1 10% PEuron-ic L 8-1 в соевом масле 0,2 рН среды поддерживают на уровне 7,0. , . Среду помещают в ферментатор на 2000 л, перемешиваемый двумя дисковыми центробежными мешалками, при скорости вращения 106 об./мин. Стерильный воздух подают со скоростью 1200 м/мин.

При необходимости добавляют 25 м антипенного агента 10% PEuronic 181 в соевом масле). Ферментацию проводят при 2бс в течение 3-5 дней и получают максимальный выход клавулановой кислоты, равный 200-300 мг/мл

Пример 13. Культивировани Streptorrrstcee c.qvue grerus

Прививочный материал получают р соответствии с описанным ранее способом при использовании среды, описанной в примере 3 (при поддержании рН среды на уровне 7,0). Его используют для инокулирования конических колб на 500 мл,содержащих 100 мл аликвоты приведенной ниже среды, приготовленной в деионизированной воде и стерилизованной. Количество прививочного материала составляет 5 вес.%.

Среда, вес.%:

Prictiem Р2241

Аркасой 501,5

КН2Р040,1

рН среды поддерживают на уровне 7,0.:

Инокулированчыв колбы встряхивают при и оптимальную р-лактамазаингибирукндая активкость достигается за 3-5 дней, В результате получают клавулановую кислоту (300500 мг/мл) .

Пример 14. Выделение сырой натриевой соли клавулановой кислоты.

Созревшую культуральнуто жидкость, полученную согласно примеру 10, осветляют в результате непрерывного центрифугирования и мицелий отбрасывают. Из 150 л ферментационной жидкости получают 120 л очищенной культуральной жидкости. Этот фильтрат дает 58%-ное.ингйбирЬвание в пробе на ингибирьвание Ь-лактамазы при разбавлении 1/2500. Фильтрат охлаждают до 5°С и прибавляют 40 л н-бутайола. Смесь перемешивают и добавля ют 25% HjSO до тех пор, пока не установится рН, равный 2. Подкислённую смесь перемешивают в течение еще 10 мин .перед разделением фаз центрифугированием. Водную фазу отбрасывают. К н-бутанольному экстракту добавляют 0,5% Norit Q5X угля и смесь перемешивают в течение 15мин Уголь после использования отбрасывают путем фильтрации с помощью диатомовой земли в качестве фильтрующего средства. К н-бутанолу добавляют 1/4 объема деионизированной воды и смесь перемешивают при добавлении 20%-ного раствора NaOH, устанавливая рН 7,0. Фазы разделяют центрифугированием и н-бутанольную фазу отбрасывают, водную фазу концентрируют при пониженном давлении до 800 мл и затем сушат на холоде. В результате получают 35 г сырого препарата клавулановой кислоты. Этот твердый препарат хранят в сухом состоянии при -20С перед предстоящей дополнительно очисткой,

Пример 15. Выделение сырой натриевой соли клавулановой кислоты.

Один литр фильтрата культуры, дающего 53%-ное ингибирование в пробе на ингибирование f -лактамазы и полученного согласно методике, описанной в примере 12, перколируют через колонку. После фильтрата культуры пропускают 300 мл дистиллированной воды для npONWBKK колонки. Элюирование активного Р -лактамазного ингибитора осуществляют О,2 М раст вором MaCl. Собирают фракции (20 мл) и испытьгеают их при конечном разбавлении 1/2500 в опыте на ингибирование j -лактамазы. Активные фракдни объединяют и концентрируют в вакууме до объема, равного 20 мл. Раствор обессоливают путем гельочищающей хроматографии на кблонке и элюируют 1%-нь м раствором н-бутанола в воде. . ,

Активные фракции объединяют,;хлористый .натрий элюируют после клавулановой кислоты и определяют с помощью раствора нитрата серебра. Обь-: единенные активные фракции концентрируют и сушат на холоде.

Один литр фильтрата культуры пос,ле обработки дает 0,45 г сырого твердого препарата клавулановой кислоты, имеющей Lдо О,92 мг/мл.

Это твердое вещество хранят при 20°С перед последующей очисткой. Пример.16. Выделение сырой .натриевой соли клавулановой кислоты. .;

-фильтрат культуры, содержащий зоб.мг/мл клавулановой кислоты подкисляют, экстрагируют н-бутанолом и клавулановую кислоту подвергают

обратной экстракции в воду при нейтральном рН.

Охлажденный фильтрат культуры закачивают.в смеситель, через впускное отверстие которого добавляют

6 вес,% азотной кислоты для установления рН на выходе из смесителя 2 ,0V ±0,1. Подкисленный фильтрат пропускают со Ькоростью 4 л/мин через охлаждаемый гликолем пластинчатый теплообменник, поддерживая температуру 2-5°С, рН концентрируют в проточной ячейке перед пропусканием через трехсекционный противоточный сепаратор.

Охлажденную воду, насыщенную н-бутанолом, прокачивают со скоростью 3 л/мин через противоточный сепаратор. Водный раствор, выходящий из противоточного сепаратора, отбрасывают. Выходящую воду удаляют из бутанольного потока, вытекающего из противоточного сепаратора с использованием делительной центрифуги для системы жидкость/жидкость. ВутаНОЛ собирают в сосуд из нержавеющей стали, снабженный рубашкой для охлаждения, в котором его хранят при тем пературе около 5 С, Из этого сосуда отбирают 40 л аликвоты и тщательно перемешивают с 2 л, охлажденной воды (5°С), насыщенной н-бутанолом. -- ,РН этой смеси устанавливают равным 6,8 + 0,1 с использованием 20%ного раствора гидроокиси натрия. Эту водную смесь экстракта и бутанола подают в смесительную центрифуту ДЛЯ систе}-ь1 жидкость/жидкость со скоростью 2 л/мин. Из 1800 л фильтрата культуры регенерируют 90 Л водной фазы, содержащей 39% клавулановой кислоты, присутствующей в фильтрате культуры. 15 л водного экстракта регулируют с помощью добавления 60 г хлористого натрия на I л таким образом, чтобы общее содержание твер дых веществ составляло 2-3%, и сушат распылением. Сухой продукт, общий йес которого составляет 1 кг, содержит 62% клавуланрвой кислоты, присутствующей в сырье, идущем на переработку. Оставшиеся 75 л водного экстракта концентрируют ультрафцльтрацией. Вод ный экстракт хранят при +5°С, поддер живая содержание твердых веществ, равное 8%, и затем сушат распрыскиванйем. Высушенный материал содержит 75% клавулановой кислоты, присутствующей в сырье поступающем на сушку распылением. Общий высушенный распылением продукт из 90 л водного экстракта содержит 69,4 г клавулановой кислоты, что составляет 72% клавулановой кислоты из сырья, идущего на сушку распылением и 21% клавулановой кислоты, присутствующей в 1800 л фильтрата культурыПример 17. Частичная очист ка сырой клавулановой кислоты. Сырые препараты клавулановой кислоты, полученные по методике, описан ной в примере 15, очищают методом ионообменнойхроматографии. 18 г материала, полученного согласно примеру 15, растворяют в 25 мл дистиллиро зайной воды и пропускают чёрё-з слой смолы в хлоридной форме. Колонку элюируют хлористым натрием, полученным .в результате подачи самотеком Of05М хлористого натрия в смесительный резервуар, содержащий 1 л дистилированной воды, который в свою очередь подают в хроматографическую колонку. 10 мл фракции собирают и Р -лактамазаингибирующую активность проверяют при 1/2500 разбавлении . фракций, активность элюируют после основной полос цвета между фракциями 24 и 30. Активные фракции собира.ют и концентрируют до объема 30 мл. Этот раствор -обессоливают и элюируют 1%-ным раствором н-бутанола . в в оде. 20 мл Фракции испытывают на содержание клавулановой кислоты-с использованием пробы на ингибирование (i-лактамазы. Фракции также наносят на бумажные полоски и опрыскивают реагентом EhrCicfi или трифенилтетразола. р) -лактамазаингибирующая активность .коррелируется с розовыми или красными пятнами, полученными в результате действия этих реагентов. Активные фракции собирают за исключением тех, которые содержат хлористыГ натрий и концентрируют в вакууме досуха. Такая методика дает 520 мг частично очищенной натриевой соли клавулановой кисЛ-оты. Тонкослойная хроматография (силикагель) такой клавулановой кислоты дает,следующие значения Rf . Верхняя фаза смеси н-бутанол: этанол: :вода- 4:1:5, i-0,21; н-бутанол: :уксуская кислота : вода - 12:3:5, . Rf 0,44; изопропанол : вода - 7:3; Rf 0,78. Зоны определяют в результате опрыскивания реагентом Ehr -icti 6-аминопенициллин, используемый в качестве метки и определяемый в результате опрыскивания этим же реагентом дает следующие значения Rf 0,3S, О , 39 и 0,77 соответственно. Пример 18. Частичная очистка натриевой соли клавулановой кислоты. . Фильтрат культуры, полученный согласно примеру 12, подвергают экстракции растворителем согласно методике, описанной в примере 14 с образованием твердого препарата, который дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии с -использованием шиэтиламиноэтилцеллюлозы. Это- твердое вещество растворяют в 20 мл дистиллированной воды, пропускают через колонку, набитую Е-52 целлюлрЗОЙ, в которой заранее устанавливают рН 7,5 с помощью 0,01 М натрийфосфатного буфера. Колонку ялюируют NaCE- градиентом. 0,1 М NaCf в 0,01 М натрийфосфатном буфере при рН 7,5 подают в смесительную камеру, содержащую 1л 0,01 М фосфатного буфера, при рН 7,5, которая в свою очередь связана с колонкой. Фракции собирают и лх испытывают на . (Ь -лактамазаингибирующую активность при разбавлении 1/2500. Эти фракции исследуют также на антибактериальную активность, объединяют, концентрируют и затем обессоливают на колонке с Biorad BiogeE Р 2. Как было обнаружено с помощью методов бумажной и тонко-елейной хроматографии, эти фракции . содержат клавуланбвую кислоту. Приме-р 19. Выделение тверой натриевой соли кЛавулйновой кислоты.. Частично очищенный гверкл : препаат клавулановой кислоты (SOO мг), полученной согласно методике примера 17, загружают в колонку с микрокристаллической СС 31 целлюлозой, В качестве хроматографического растворителя используют верхнюю фазу смеси н-бутанол : этанол : вода в соотношении 4:1:5. Хроматографированиё проводят при и 4 мл фракции собирают . Фракции испытывают на присут ствие клавулановой кислоты путем нанесения на фильтровальную бумагу и опрыскивания реагентом ElirEicii (розовое пятно) или триценилтетразолом (красное пятно). Делают пробы на ин гибирование р -лактамазы при 1/2500 ;разбавлении. Активные фракции объ;единяют и сушат в вакууме на рота:ционном испарителе. Твердое вещество растворяют в небольшом объеме дистил лированной воды и сушат на холоду. Получают белый твердый препарат натриевой соли клавулановой кислоты. Пример 20. Выделение твердой натриевой соли клавулановой кислоты. . концентрированный экстракт, полученный в результате ультрафильтрации в примере 16, содержит 10 г клавулановой кислоты. Этот экстракт перколи руют со скоростью 1 л/ч через колонj y анибнробменной смолой в хлоридной форме. Затем колонку промывают 2. л деионизированной воды перед элюированием градиентом хлористого натрия. Градиент создают пропусканием через резервуар, содержащий 4 л 1,4 М NaCl через перемешиваемый резервуар, содер жащий 4 л NaCl, который соединен с перемешиваемым резервуаром, содержащим 4 л деионизированной воды. Последний соединен с. помощью насоса с колонкой. Колонку элюируют со скоростью 2,5 мл/мг и 25 мл фракции собирают. Фракции испытывают на икгибирование Э-лактамазы. Активные фракции объединяют и выпаривают в вакууме досуха. Затем до- бавляют этанол (500 мл) и твердое ве щество отфильтровывают после интен.сивного перемешивания. Затем этаноль Нйй экстракт выпаривают в вакууме досуха на ротационном испарителе и повторно растворяют в деионизированной воде (40 мл). Затем его загружают в колонку, набитую Bjorad р)-лактамазы Ингибирование

Источник р(лактамазы

Stapti &ococcus aureus (RusseE,,) Eschet icbia coti ЛТ 4 Escherictiia coti В RtebsieECa aerogrenes A Pseudomonas aerog inosa 822 (R factor) JPseudomonas daEgEeisti

Приблизительное значение X относительно Esctierichia coEi Т 4 si

1,0 1,0 2,0 0,6 5,0 0.1 Siog-eC ,Р2, элюируют 1%-ньш раствором н-бутанола. Фракции собирают и испытывают на (i-лактамаэаингибирующую активность при конечном разбавлении 1/2500. Опыты по определению содержан;ия хлористого натрий при разбавлении фракцией в соотношении 1/25 осуществляют с исполлзованием раствора нитрата серебра. ти фракции, содержащие клавулановую кислоту, свободную от хлористого натрия, объединяют, концентрируют путем выпаривания растворителя при пониженном давлении до 20 мл и затем сушат на холоде. В результате этого получают 4,8 г натриевой соли клавулановой кислоты. Пример 21. Получение натриевой соли клавулановой кислоты. 0. еНгОН rf ч/ СОгСНгСбНб ,3 Практически чистый бензилклавуланат в этаноле, содержащем кислый углекислый натрий, гидрируют над 10%ным пеногасителем в течение 25 у5ин при комнатной температуре и атмосферном давлении. Катализатор отфильтровывают, промывают водой и этанолом/ и объединенные фильтраты выпаривают при пониженном давлении при комнатной температуре. Оставшееся полутвердое вещество растирают в порошок в присутствии ацетона, фильтруют и промывают эфиром с образованием натрийклавуланата, П р И м е р 22. Ингибирование р -лактамазы натриевой солью клавулановой .кислоты. Клавулановая кислота прогрессивно и необратимо ингибирует -лактамаЗУ, вырабатываемую Е setter ictiiaВ табл. 3 приведено ингибированиё р| -лактамазы клавулановой кислотой. Таблица 3 улановой кислотой При использовании совместно с пенициллином G в качестве субстрата, Jjo натриевой соли клавулановой кис лоты против Р -лактамаэы, вырабаты ваемой Slapti. (Jureus (RusseCK) сбставляет приблизительно 0,06 мг/мл Пример 23. Получение клавулан,ата натрия. Бензил клавуланат (840 мг) SB этаноле (30 мл) и воде (5 мл) гидрируАнтибактериальный спектр натриевой соли клавулановой кислоты

Бактериальный штамм

Staph tococcue aureu%(0xfordh ) Staph-stococcus aureus (Ru5se &) BacieCus 5ubtif-is Streptococcus faecatis Streptococcus p-sogenes CN10 Esctierichio coti NCTC 10416 KCebsietCa aerogrenes

KEebbietEa oxvtocum Enterobacter aerogenes T624 Enterobacter c&oacae Acinetobacter anitratus Provldentia stuartiv Serratia marcescens Proteus miratiEis C977 Proteus votgans W09O SafcmonetCa isptiimurium

Sti-igreEto Sonnei

Pbeixk5monas aerugfinosa A

Предлагаемое антибактериальное вещество (клавулановая кислота) может быть представлено структурной формулой д tHzOH

О

COjH

Полное химическое наименование клавулановой кислоты - Z -(2В, 5R -3- ( fb -гидроксиэтиледен) -7-оксо-4-окса-1-азабицикло (3,2,0) гептан-2-карбрновая кислота.

Она способна ингибировать-рост штаммов разновидности Stapli- Eococ.Cus Qureus, обладает синергитическим действием в отношении анти бактер ицидного эффекта ампициллина

против р -лактамазапроиэводящих , Esctierichia coei, Во aerog eries и Staplrseococcus аигеи, синергитическим действием в отношении антибактерицидного эффекта це64

Минимальная ингибирующая концентрация, мг/мл

7,5 7,5 62

500

125

31

31-62

62

31

62

125

125

125

62

31

31

62

500

фалоридина против fb -лактамазапро45 изводящих штаммов Proteus (biCi4 и StoiptivEococcus aufeusНаиболее применимыми солями клавулановой кислоты являются например такие, как натриевая, калиевая, кальциевая, магниевая, алюминиевая, аммонийная и замещенные аммониевое соли, такие как триметиламмониевая, бензатин, прокаин, а также аналогичные соли, которые получают обычным способом при реакции с пенициллинами или цефалоспоринами.

Клавулановая кислота и ее соли обладают ценными терапевтическими свойствами и могут применяться для лечения инфекции у млекопитающих, включая человека, в различных формах, таких, как таблетки, капсулы, кремы, сиропы (микстуры), суспензии, растворы, способные к повторному составлению порошки, а также стерильные 267 мг) и бикарбонают над 10% том натрия (244 мг) в течение -25 мин при комнатной температуре и атмосферном давлении. Катализатор отфильтровывают, промывают водой и этанолом и объединенные фильтраты выпаривают, а продукт кристаллизуют. Предлагаемое вещество обладает широким спектром антибактериальной активности, что показано в табл. 4. Таблица 4

21648117 22

формы, пригодные для инъекции илиотличающийся тем, что

вливания.штамм Streptom(ces cCavueigrePus

Предлагаемое вещество обладаетАТСС 27064 выращивают на питательной широким спектром антибактериальнойсреде, содержащей источники углероактивности и может быть использовада, азота и минеральные соли, с поено для лечения инфекционньк заболе-ледующей экстракцией целевого продукваний.б та из подкисленной среды органическим Формула изобретениярастворителем, не смешивающимся с

Г 2« Способ по п. 1, отличаюQ и и с я тем, что экстракцию осуще СОгНствляют н-бутиловым спиртом.