Способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием Советский патент 1979 года по МПК A61K35/66 

и качечтве щелочи используют гндроoi ncn натрия, калия, кальция или аммония. ЕС. :М.:ст|)агирование проводить с: ис ;|;;и зипан 10м высоко концентрированных 8ОДЦЫХ ;це;1очпых растворов с самого начала без предварительного проведения водного экстрагирования, выход экстракта очень высок па первой стадии экстрагирования, но {)езки падает на второй и последующих стадиях. Полученный экстракт нейтрализуют обычным методом с иснользованием разбавленной соляной кислоты, а затем подвергают рафинированию. Могут быть различные методы рафинирования, такие как ультрафильтрация, реверС1 вный осмос, гельфильтрация, высаливание, которые «огут быть иснользованы по от.де;1ьности или в комбинации друг с друЭ,яементарный анализ полученного полисахарида показывает, что полисахарид состоит из углерода, водорода, азота и кислорода. Молекулярный вес полисахарида находится в пределах от 5000 до 300000, сред11ИЙ- молекулярный вес находится в дканазоне от 10000 до 100000. фракции с низким молекулярным весо.м (меньще 5000) обладают почти нулевым ингибиторг ым действием против саркомы-180 твердых опухолей на мышах при внутримышечном введении., а также они имеют горечь, неприятный запах и побочные действия. Полисахариды, полученные предлагаемым способом, оказывают противоопухолевое действие на мыщей не только при внутримыщечном введении, но и при пероральном введении. Полисахариды вызывают побочпых действий в химиотерапии рака и увеличивают чувствительность к радиотерапии, предотвращают инфекционные болезни, вызываемые вирусами или бактериями, прн перорально.м введении улучшают жизненные функции, улучшая аппетит, работу кишечника. Пример 1. 200 г сухой мицелы (содержание влаги 9,9%) кориолуса разноцветного (Fr.) Quel. (FERM-P NO.2414), полученной из искусственной культуры, и 3 л воды помецдают в сосуд емкостью 5 л, снабженный мешалкой. Смесь перемешивают на кипящей водной бане и выдерживают при этих условиях в интервале температур 95±2°С в течение 3 ч. Затем смесь охлаждают и подвергают отсасывающей фильтрации путем использования воронки Бюхнера для разделения грибов и экстракт-раствора, затем осажденный мицелий промывают л воды и смешивают с экстракт-раствором. Смешанный раствор составляет около 3,5 л.рН экстракт-раствора 5,8. Оставшуюся мицелу затем снова смешивают с 2 л воды, затем подвергают примерно двухчасовой экстракции и промыванию 1 л воды до получения 3 ..ч экстракт-раствора. Конечный грибной остаток снова смешивают с 2 л 0,1 н. раствора гидроокиси натрия и подобным же образом экстагируют при 95:г2°С в течение 2 ч с последующим охлаждением,, нейтрализацией 2 N соляной кислотой и отсасывающей фильтрацией для отделения экстракт-раствора п остатка грибов. После отделения остаток промывают 500 см воды и смешивают с экстракт-раствором до получения 2,5 л раствора. Подобные операции повторяют с ис1Юльзованием 2 л 0,2н., 0,3 н. и 0,4 н. растворов гидроокиси натрия и 0,5 .я промывной воды до получения 2,5 л экстракт-раствора нз каждого процесса. Эти шесть порций экстракт-раствора {общее количество 16,5 л) сливают вместе и концентрируют вакуу.мным концентратом (роторный испаритель) при 60°С до 700 см и затем по.мещают в цел.люлозную трубку для диализа при действии тока диализа при 5°С в течение 72 ч, и полученный диализат затем концентрируют и подвергают сущке вымораживанием до получения 60 г коричневого noponjKa с содержанием влаги 7°/о (выход 31,1 /о). Элементарный анализ этогч) норощка дает 40,3-/о углерода, 6,2% водорода, 2,9% азота и 50,б% кислорода. Молекулярный вес этого вещества, определенный на хроматографической колонке, Г1риблизитель :о 10000-250000, а средний молекулярный вес, определенный с но.мощью .метода ультрацентрифуги с использованием ВОДЬ в качестве растворителя, 94000. Опыты показали, что порошкообразное вещество - это азотсодерж.щий полисахарид. Ингибирующее действие этого вещества против Саркомы-180 твердых опухолей на мышах быочо высоким, равн.ы.м при внутримышечном введении 70°/о при введении нерора,.. Противооггухолевое действие этого вещества определяют с обычного метода . Опухоли клети саркома-180 пересаживают в брюшную полость мышей после интенсивного роста в течение 7 дней, 10 этих клеток пересаживают под кожу влагалища других мышей для образования твердых опухолей. При внутримышечном введении препарат дают в дозе 10 мг/кг один раз каждый день в течение 20 дней при общей дозе 0,2 мл на 20 г (веса мыши), а при пероральном введении полисахарид дают в дозе 1,000 мг/кг один раз в день в течение 20 дней при общей дозе 0,2 мл/20 г (веса тела мыши). Опухоли образуют ядро на 25-й день после пересаживания, а задерживание роста опухоли в процентах подсчитывают как отношение среднего веса опухоли в мышах, которое дает полисахарид, и среднего веса опухоли в контрольных мышах. Результаты - подобного рода опытов экстракции, проводимые с использованием только одной воды в качестве растворителя, показаны ниже в табл. 1. В этих опытах все стадии экстракции и промывания осуществляют путем использования воды в тех же количествах, в которых используют растворитель при упомянутой выше обработке. В этом случае экстракт-раствор (смешанный с промывной водой) подвергают концентрированию с помощью вакуума, диализу, охлаждению и сушке, чтобы определить выход в каждой стадии экстрагирования. Эти результаты показаны в таблице. Из этой таблицы очевидно, что выход при экстрагировании резко падает во 2-й и последующих стадиях экстрагирования. Пример 2. Используя ту же самую аппаратуру, как и в примере 1,200 г сухой мицелы (содержание влаги 8,8%) кориолуса разноцветного (Fr.) Quel (FERM-P N0.2414} экстрагируют с помощью 2 л 0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 н. растворов гидроокиси натрия. Температура экстрагирования 90-95°С и время экстрагирования составляет 2 ч в каждой стадии экстрагирования. После каждой стадии экстрагирования смесь охлаждают, нейтрализуют 2 N раствором соляной кислоты, а затем подвергают отсасывающей фильтрации для разделения осадка грибов от экстракт-раствора. Осадок промывают 500 см воды после каждой стадии экстрагирования, и промывной раствор смешивают с соответствующим экстракт-раствором. Экстракт-раствор на каждой стадии экстрагирования подвергают вакуумному концентрированию, диализу, концентрированию в сушке вымораживанием таким же образом, как это делают в примере 1, лТ,о получения коричневого порошка. Результаты экспериментов по получению продукта в соответствующих стадиях экстрагирования показаны ниже в табл. 2. Общий выход 27%, элементарный анализ каждого продукта, %; углерод 41,0; водород 6,3; азот 3,7; кислород 49,0. Определено, что вышеупомянутый порошок в азотсодержащем полисахариде имеет молекулярный вес от 10000 до 250000, а средний молекулярный вес 100000. Соотношение, оказывающее ингибирующее действие против Саркомы-180 твердой опухоли, на мышах 93% при внутримышечном введении и 73% при пероральном введении. Для сравнения выхода при экстрагировании такие же эксперименты, как в примере 1, были проведены с использованием 1 н. и 0,4 н, растворов гидроокиси натрия с получением результатов, приведенных ниже в табл. 3. Как следует из таблицы, выход падает, когда экстрагирование повторяют при использовании экстракт-раствора той же самой концентрации, и очень трудно получить высокий выход, такой же,как при многостад Йном экстрагировании. Пимер 3. Используя аналогичную аппаратуру, как в примере 1, 200 г сухой мицелы (содержание влаги 9,9%) кориолуса разноцветного (Fr) Quel. (FERM-P NO. 2414) подвергают первичному экстрагированию 3л воды при 95 ± 2°С в течение 3 ч, а затем после охлаждения подвергают отсасывающей фильтрации для разделения осадка мицелы и экстракт-раствора, осадок мицелы затем промывают водой в количестве 1 л и затем смешивают с экстракт-раствором с получением 3,5 л экстракт-раствора. Затем к осадку добавляют 2 литра 1 н. раствора гидроокиси натрия для экстрагирования при 90-95°С в течение 0,5 ч, раствор затем охлаждают, нейтрализуют 2 N соляной кислотой, подвергают отсасывающей фильтрации, промывают 1 л воды. В результате этих операций получают 3 л экстрактраствора и остаток грибов. Все экстракт-растворы, полученные в результате проведенных операций, смешивают вместе и подвергают вакуумному концентрированию, диализу, дальнейшему концентрированию и сушке вымораживанием таким же образом, как в примере 1, в результате чего получают 33 г коричневого порошка с содержанием влаги 7% (вы.чод 21,0%). Результат элементарного анализа этого порошка показал, что порошок состоит из 41,7% углерода, 6,4°/о водорода, 3,9% азота и 48,0% кислорода. Было обнаружено, что это вещество - азотсодержащий полисахарид с молекулярным весом от 10000 до 300000 и средним молекулярным весом 98000. Ингибирующий эффект этого вещества против твердых опухолей саркома-180 на мышах оказался высоким и составляет 94% при вынутримышечном введении и 68% при пероральном введении. Пример 4. Пспользуя аппаратуру, такую же, как в примере 1, 200 г сухих плодовых тел Кориолуса разноцветного (Fr.) Quel (FERM-P NO. № 2414) с содержанием влаги 8,7% первоначально подвергают экстрагированию-с помощью 2,4 л воды при 95 ± :г2°С в течение 3 ч. Продукт после охлаждения подвергают отсасывающей фильтрации для разделения осадка и экстракт-раствора, затем осадок промывают 500 см воды, и про.мывные воды смешивают с экстрактраствором, получив, таким образом, около 2,5 л экстракт-раствора. Осадок затем смешивают с 2 л 0,4 н. раствора гидроокиси натрсия и подвергают экстрагированию при 90±2°С в течение 1 ч, охлаждают, нейтрализуют 2 N раствором

сслшиои кислоты, подвер а1от отсасьшающей фИоТьтрации и промывают 500 см воды, в результате чего получают 2,5 л экстракт-раствора и осадок. Подобную one рацию экстрагирования повторяют с 2 л 1 н. раствора гидроокиси натрия при 80±2°С в течение I ч, в результате чего получают 2,5 л экстракт-раствора.

Все экстракт-растворы сливают вместе и подвергают концентрированию под вакуумом, диализу, концентрированию и сушке вымораживанием таким же образом, как в примере 1, при этом получают 43,4 г коричневого порошка с содержанием влагп 7,5% (выход 22%). Результат элементарного анализа этого порошка показал наличие 42,3% углерода, 6,5% водорода, 2,2 азота и 49,0% кислорода. Порошок представляет собой азотсодержащий полисахарид с молекулярным весом 110000.

Ингибрирующее действие этого вещества против твердых опу.холей Сарко.ма-180 на мышах высокое и равно 96% при внутримышечном введении .- 75% при перорально.м введении.

Для сравнения величин, выхода подобный процесс экстрагирования был проведен с использованием только одной воды в качестве растворителя. Выход порошка в это.м случае был всего только 7,6%.

Предлагаемый способ обеспечивает высокий выход целевого продукта до 31,1%.

Таблица 1

3

2

2

2

2

2

ее коли13во

Примечание: Количество мицел, используемое как исходный материал 200 г; температура экстрагирования 95 ± 2 С.

0,05 0,1 0,2 0,4

7,0

2,1

0,8

0,3 0,1 0,1

10,4

Т

и л и ц а

10,1 3,5 6,8 6,6

Формула изобретения

Таблица

Coriolus pargarnenus (Fr.) Pat., Coriolus biformis (KLotz.) Pat., a затем осуществляют повторное многократное экстрагирование водным раствором ще1лочи с постепенно возрастающей концентрацией, не превышающей 2N.

в

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Заявка Японии № 50-32304, кл. 30 А 32, опублик. 1975.